目的:探讨中药茯苓及复方制剂对铝致老年痴呆症(AD)小鼠治疗效果的观察及对乙酰胆碱转移酶(chAT),乙酰胆碱酯酶(AchE)的影响。方法:建立铝致AD小鼠动物模型,将50只小鼠分为正常组、模型组、治疗1组和治疗2组;除正常组外,造模组用D-半乳糖 + AlCl
3混合水溶液腹腔注射(Al
3+ + 浓度2 mg/ml的三氯化铝水溶液按5 mg/kg体重剂量给小鼠稀释后腹腔注射60天)。治疗1、2组在铝染毒2个月后同时给予中药复方制剂不同剂量灌胃,模型组和正常组用等量体积蒸馏水灌胃,直至实验结束。在实验前、后分别进行水迷宫游水试验,并测定血红蛋白;实验结束后取血,分离血清,测定血清生化指标;处死小鼠取脑,称脑重量,制成脑匀浆,离心取上清,分别测定脑中乙酰胆碱酯酶(AchE)、乙酰胆碱转移酶(chAT)、超氧阴离子自由基(
龙奇军1,邓钰莹1,谭川铃1,邹丹1,许淑妹1,田海潮1,张树球2*,周国荃3
1右江民族医学院重金属与氟砷毒物研究实验室,广西 百色
2广西百色高新区科技企业孵化基地研发中心,广西 百色
3美国密西根州立大学环境科学毒理学教研室,兰辛,密西根州,美国
收稿日期:2019年6月11日;录用日期:2019年6月20日;发布日期:2019年6月27日
目的:探讨中药茯苓及复方制剂对铝致老年痴呆症(AD)小鼠治疗效果的观察及对乙酰胆碱转移酶(chAT),乙酰胆碱酯酶(AchE)的影响。方法:建立铝致AD小鼠动物模型,将50只小鼠分为正常组、模型组、治疗1组和治疗2组;除正常组外,造模组用D-半乳糖 + AlCl3混合水溶液腹腔注射(Al3+ + 浓度2 mg/ml的三氯化铝水溶液按5 mg/kg体重剂量给小鼠稀释后腹腔注射60天)。治疗1、2组在铝染毒2个月后同时给予中药复方制剂不同剂量灌胃,模型组和正常组用等量体积蒸馏水灌胃,直至实验结束。在实验前、后分别进行水迷宫游水试验,并测定血红蛋白;实验结束后取血,分离血清,测定血清生化指标;处死小鼠取脑,称脑重量,制成脑匀浆,离心取上清,分别测定脑中乙酰胆碱酯酶(AchE)、乙酰胆碱转移酶(chAT)、超氧阴离子自由基( O 2 ˙ ¯ )清除率、谷胱甘肽等含量;另部分脑用甲醛处理后作病理检查。结果:大脑(AchE)活力,正常组、模型组、治1组、治2组依次为,5.77 ± 1.52▲、6.02 ± 0.79、7.30 ± 0.59、5.27 ± 1.09▲▲ (U/mg.prot ),与治疗1组比较,▲P < 0.05,▲▲P < 0.01,差异有统计学意义;治疗1组明显升高;脑乙酰胆碱转移酶(chAT)活力依次为,29.25 ± 13.42★、7.05 ± 5.07▲、52.95 ± 25.79▲★★、53.95 ± 12.82▲★★ (U/g组织湿重),与正常组比较,▲P < 0.05,与模型组比较,★P < 0.05,★★P < 0.01,差异有统计学意义;模型组明显降低;血清乙酰胆碱酯酶(AchE)活力依次为51.79 ± 2.12▲▲、44.71 ± 2.21★★、55.41 ± 2.10★▲▲、41.30 ± 3.36★★▲▽▽ (U/ml),与正常组比较,★P < 0.05,★★P < 0.01,差异有统计学意义;与模型组比较,▲P < 0.05,▲▲P < 0.01,差异有统计学意义;与治疗1组比较,▽▽P < 0.01,差异有统计学意义;模型组明显降低;脑铝Al3+含量依次为135.00 ± 8.37、149.40 ± 0.89、147.43 ± 4.83、118.75 ± 6.41 (ng/ml),超氧阴离子自由基( O 2 ˙ ¯ )清除率依次为27.65 ± 4.81、14.71 ± 3.60、22.65 ± 8.67、21.57 ± 6.14 (%),造模前、中、后,Hb依次为正常组无明显变化、模型组降低、治疗组先降低后升高。结论:铝可导致大脑chAT下降、AchE活性升高,乙酰胆碱减少,胆碱能神经障碍,认知功能障碍,可能是老年痴呆症发病的重要原因,同时铝又使动物抗氧化能力降低,加重疾病;本中药复方制剂通过排铝、恢复(chAT) (AchE)酶活力,提高抗氧化能力,治疗后对老年痴呆症有明显疗效。而茯苓(治1组)比复方制剂疗效较差。
关键词 :铝,老年痴呆症,乙酰胆碱酯酶,抗氧化能力
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铝是地球上含量最多的金属元素之一,与人类的生产生活关系非常密切。过去一直认为铝是无毒元素,而近年来研究发现铝也有一定的毒性,虽毒性较低,且体内积蓄量较少,但如长期积蓄在大脑,特别是颞叶皮层,海马结构中,与神经元纤维变性,缠结,神经元细胞减少有关,研究发现老年痴呆症患者大脑神经组织中铝含量是正常人的1.5~30倍,因此有学者认为铝与老年痴呆症(AD)发病有密切关系 [
氯化铝、硝酸铝、D-半乳糖、亚硝酸钠、氯化钠,氰化钾、高铁氰化钾、无水磷酸二氢钾、过硫酸铵、1-奈胺、盐酸羟胺、对氨基苯磺酸、盐酸(HCL)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、四甲基乙二胺(TEMED),均为国产分析纯。各种测试盒,乙酰胆碱酯酶(AchE)测试盒、乙酰胆碱转移酶(chAT)测试盒、谷胱甘肽(GSH)测试盒、尿素氮测试盒、甘油三酯(TG)测试盒、总胆固醇(TC)测试盒、谷丙转氨酶测试盒,购自南京建成生物工程研究所有限责任公司。
茯苓干品,购自市中药店,自提:称取中药→放锅内→加自来水20倍→加热煮沸40分钟→过滤加热浓缩→冷却→加3倍量v/v 95%乙醇沉淀过夜→过滤弃沉淀→回收乙醇→药液定容→装瓶→105℃高压消毒30分钟→放冰箱保存待用。中药复方制剂(中药复方抗痴呆制剂,商品名:植物饮液,专利号:ZL201210339742.8)由广西百色高新区科技企业孵化基地研发中心提供,由绿豆、金银花、茯苓、甘草等组成。
小白鼠50只,昆明种,健康,雌雄各半,鼠龄12个月。由学院动物室提供(动物使用许可证号:SYXK桂2011-0010。动物生产许可证号:SCXK桂2012-0003)。
将小鼠分成4组,每组24只(雌雄各半),即正常组、模型组、治疗1组(大剂量组)、治疗2组(小剂量组)。模型组和治疗1、2组共40只先用氯化铝 + D-半乳糖造模 [
利用Y型水迷宫,测定小鼠记忆力,测试方法按参考文献。开始预先训练5~8天(d),每天游水训练3次,使其熟悉上岸地点。测试:连续3天,每天3次,计算自下水至到达上岸地点的时间(s)和错误次数(错误率),超过40秒/次,算失败 [
取小鼠尾巴全血20 ul,用高铁氰化钾(HiCN法)测定,具体操作参考文献 [
数据用SPSS-13软件处理,进行方差分析和Q检验,结果用( x ¯ ± s )表示。
结果显示,组间比较,造模前小鼠血红蛋白(Hb)各组间差异无统计学意义。治疗前(造模后),正常组明显高于其他各组,P < 0.01;治疗后,正常组明显高于其他各组,P < 0.01;组内比较,正常组前、中、后,无明显变;其他各组,均明显降低。见表1。
方差分析:血红蛋白Hb,造模前:各组间比较,F = 0.383,p = 0.766,差异无统计学意意义。治疗前Hb:F = 24.435,p = 0.000,与正常组比较,▲▲P < 0.01;与治2组比较,★P < 0.05,★★P < 0.01差异有统计学意义。治疗后Hb:F = 15.723,p = 0.000,与正常组比较,★★P < 0.01;与模型组比较,▲▲P < 0.01,差异有统计学意义。
组内比较:前、中、后,正常组:造模前、中、后比较,F = 0.036,p = 0.968,差异无统计学意义;模型组:造模前、中、后比较,F = 12.685,p = 0.00,与造模前比较,明显降低,aP < 0.01;差异有统计学意义;治疗前与治疗后比较。差异无统计学意义;治1组:造模前、中、后比较,F = 41.992,p = 0.00,与造模前比较,明显降低,bP < 0.01差异有统计学意义;治疗前与治疗后比较,cP < 0.01差异有统计学意义;治2组:F = 82.712,p = 0.00,与造模前比较,明显降低,dP < 0.01,差异有统计学意义;治疗前与治疗后比较,fP < 0.01,差异有统计学意义。
组别 | 造模前 | 治疗前(造模后) | 治疗后 |
---|---|---|---|
正常组 | 157.64 ± 28.11 | 156.80 ± 3.88★★ | 159.73 ± 22.82▲▲ |
模型组 | 150.00 ± 22.88 | 112.29 ± 11.58▲▲★a | 118.40 ± 10.25★★a |
治1组 | 156.81 ± 13.90 | 100.05 ± 23.69▲▲★b | 123.97 ± 15.40★★bc |
治2组 | 153.16 ± 15.63 | 95.97 ± 13.08▲▲d | 114.80 ± 9.78★★▲▲df |
表1. 造模前、中、治疗后血红蛋白(Hb)比较( x ¯ ± s )(g/L)
结果显示,TG,各组间比较,差异无统计学意义;(TC),各组间比较,差异有统计学意义;尿素氮,各组间比较,差异有统计学意义。见表2。
组别 | TG(mmol) | TC(mmol) | 尿素氮(mmol) |
---|---|---|---|
正常组 | 1.35 ± 0.47★ | 4.03 ± 0.43 | 9.48 ± 0.66 |
模型组 | 2.12 ± 0.81▲ | 3.01 ± 0.90★★ | 9.68 ± 5.37 |
治1组 | 1.12 ± 0.43 | 3.23 ± 0.26★ | 5.27 ± 1.39▲▲★★ |
治2组 | 2.36 ± 0.84▲▲ | 2.95 ± 0.64★★ | 5.24 ± 0.73▲▲★★ |
表2. 小鼠血清甘油三脂(TG)、总胆固醇(TC)、尿素氮含量比较( x ¯ ± s )
方差分析:方差分析:TG,各组间比较,F = 5.243,p = 0.007,与治1组比较,▲P < 0.05,▲▲P < 0.01,差异有统计学意义,与治2组比较,★P < 0.05,差异有统计学意义;TC,各组间比较,F = 4.680,p = 0.009,差异有统计学意义,与正常组比较:★P < 0.05,★★P < 0.01,差异有统计学意义;尿素氮,各组间比较,F = 7.260,p = 0.001,与正常组比较:▲▲P < 0.01,与模型组比较:★★P < 0.01,差异均有统计学意义。
结果显示, 血清谷丙转氨酶(ALP)、脑铝Al3+含量,各组比较,均有明显差异。见表3。
组别 | 谷丙转氨酶(U/L) | 脑铝Al3+(ng/ml) |
---|---|---|
正常组 | 51.54 ± 5.46 | 135.00 ± 8.37★★▲▲ |
模型组 | 57.18 ± 14.24 | 149.40 ± 0.89▲▲ |
治1组 | 46.53 ± 5.15▲ | 147.43 ± 4.83▲▲ |
治2组 | 58.00 ± 9.41 | 118.75 ± 6.41★★ |
表3. 小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、脑铝Al3+含量比较
方差分析:谷丙转氨酶:各组间比较,F = 2.319,P = 0.100,与治2组比较,▲P < 0.05,差异有统计学意义;脑铝Al3+,各组间比较,F = 39.450,P = 0.000,与模型组比较:★★P < 0.01,与治2组比较:▲▲P < 0.01差异有统计学意义。
结果显示,造模前、造模后(治疗前)、治疗后水迷宫时间。各组间无明显差异,前中后也均无明显变化。见表4。
组别 | 造模前s | 治疗前s | 治疗后s |
---|---|---|---|
正常组 | 4.66 ± 1.08 | 4.26 ± 0.73▲▲ | 5.31 ± 1.95★★ |
模型组 | 5.02 ± 1.26 | 10.42 ± 4.75a | 9.29 ± 3.79b |
治1组 | 4.96 ± 1.40 | 6.31 ± 1.60▲▲c | 6.33 ± 1.38★c |
治2组 | 4.24 ± 0.96 | 7.62 ± 2.96▲★d | 6.31 ± 1.62★f |
表4. 造模前、造模后、治疗后水迷宫时间(秒,s)比较( x ¯ ± s )
方差分析:组间比较:造模前:F = 1.341,P = 0.272,差异无统计学意义;治疗前:F = 6.997,P = 0.001,与模型组比较,▲P < 0.05,▲▲P < 0.01,与正常组比较,★P < 0.05,差异有统计学意义;治疗后:F = 3.685,P = 0.027,与模型组比较,★P < 0.05,★★P < 0.01差异有统计学意义。
组内比较:正常组:前,中,后比较,均无明显变化,差异无统计学意义;模型组:前,中,后比较:F = 5.022,P = 0.017,有明显变化,与造模前比较,bP < 0.05,cP < 0.01,差异有统计学意义;治1组:前,中,后比较:F = 4.564,P = 0.016,与造模前比较,cP < 0.05,造模后(治疗前)和治疗后均明显升高,差异有统计学意义,但治疗后无明显下降;治2组:前,中,后比较:F = 11.012,P = 0.000,与造模前比较,fP < 0.05,dP < 0.01,差异有统计学意义,但治疗后有下降。见表5。
组别 | 造模前 | 治疗前 | 治疗后 | |||
---|---|---|---|---|---|---|
错误率% | 失败率% | 错误率% | 失败率% | 错误率% | 失败率% | |
正常组 | 1.39 | 0 | 6.35 | 0 | 19.04 | 0 |
模型组 | 6.67 | 0 | 64.44 | 0 | 38.09 | 3.17 |
治1组 | 8.33 | 0 | 36.11 | 0 | 30.87 | 1.23 |
治2组 | 2.78 | 0 | 34.03 | 0 | 25.64 | 3.42 |
表5. 造模前、造模后、治疗后水迷宫错误率%、失败率%比较
方差分析:造模前:各组均有错误,错误率治1组最高,正常组最低,失败率为0;造模后:各组均有错误,且比造模前增加, 模型组增加最多,正常组最低,但失败率为仍0;治疗后:治1组、治2组、模型组三组都有失败,但正常组为0;而模型组错误率仍最高和失败率%也较高,说明记忆功能下降较严重。
结果显示,(AchE)活力治疗1组明显高于其他组;脑乙酰胆碱转移酶(chAT)活力,模型组明显低于其他组;血清乙酰胆碱酯酶(AchE)活力,模型组和治疗2组明显低于正常组和治疗1组;见表6。
组别 | 脑(AchE)活力(U/mg.prot) | 脑(chAT)活力(U/g组织湿重) | 血清(AchE)活力(U/ml) |
---|---|---|---|
正常组 | 5.77 ± 1.52▲ | 29.25 ± 13.42★ | 51.79 ± 2.12▲▲ |
模型组 | 6.02 ± 0.79 | 7.05 ± 5.07▲ | 44.71 ± 2.21★★ |
治1组 | 7.30 ± 0.59 | 52.95 ± 25.79▲★★ | 55.41 ± 2.10★▲▲ |
治2组 | 5.27 ± 1.09▲▲ | 53.95 ± 12.82▲★★ | 41.30 ± 3.36★★▲▽▽ |
表6. 脑乙酰胆碱酯酶(AchE),乙酰胆碱转移酶(chAT),血清乙酰胆碱酯酶(AchE) ( x ¯ ± s )
方差分析:组间比较:乙酰胆碱酯酶(AchE)活力:F = 4.454,P = 0.014,与治疗1组比较,▲P < 0.05,▲▲P < 0.01,差异有统计学意义;脑(chAT)活力:F = 10.230,P = 0.001, 与正常组比较,▲P < 0.05,与模型组比较,★P < 0.05,★★P < 0.01,差异有统计学意义;血清(AchE)活力:F = 34.910,P = 0.000,与正常组比较,★P < 0.05,★★P < 0.01,差异有统计学意义;与模型组比较,▲P < 0.05,▲▲P < 0.01,差异有统计学意义; 与治疗1组比较,▽▽P < 0.01,差异有统计学意义。
结果显示,(AchE)活力正常组明显高于其他组;自由基( )浓度,正常组明显低于其他组;谷胱甘肽(GSH),治疗1组和治疗2组明显低于正常组和模型组;见表7。
组别 | 自由基( O 2 ˙ ¯ )(清除率%) | 自由基( O 2 ˙ ¯ )浓度(µmol/L) | 谷胱甘肽(GSH) (µmol/L) |
---|---|---|---|
正常组 | 27.65 ± 4.81 | 2.38 ± 0.25▲▲ | 27.95 ± 4.52 |
模型组 | 14.71 ± 3.60▲▲ | 3.05 ± 0.21 | 29.65 ± 5.76 |
治1组 | 22.65 ± 8.67 | 2.63 ± 0.29▲ | 27.53 ± 5.77 |
治2组 | 21.57 ± 6.14 | 2.67 ± 0.21▲ | 32.26 ± 5.36 |
表7. 脑自由基( )清除率%、自由基( O 2 ˙ ¯ )浓度(µmol/L),谷胱甘肽比较()
方差分析:组间比较:自由基( O 2 ˙ ¯ ): F = 3.223,P = 0.051,与正常组比较,▲▲P < 0.01,差异有统计学意义;自由基浓度(µmol/L):F = 6.066,P = 0.005,与模型组比较,▲P < 0.05,▲▲P < 0.01,差异有统计学意义;谷胱甘肽(GSH):F = 1.185,P = 0.338, 各组比较,差异无统计学意义。
1) 造模前、中、治疗后血红蛋白(Hb),造模前后各组间无明显差异;造模后(治疗前)、治疗后除正常组无明显变化外,各组均低于造模前,提示造血系统己受抑制。治疗后有所恢复。高浓度铝抑制亚铁氧化酶活性,影响铁的利用,铝影响d-ALA脱水酶,影响血红素的合成,进而影响血红蛋白合成,贫血。
2) 正常脑组织含铝量(平均为1~2 mg/kg干重),含量升高可引起铝性脑病。文献表明,铝可使皮层颞叶,海马胆碱乙酰转移酶(chAT)活性降低25%~40%,使乙酰胆碱(Ach)减少,是影响动物记忆的主要原因之一。铝还使额叶,顶叶,颞叶皮层的5-羟色胺(5-HT)含量降低,去甲肾上腺素含量减少。铝可使神经元cAMP升高,促使蛋白磷酸化,微管蛋白磷酸化使其结构变化,结果形成纤维缠结。本实验模型组乙酰胆碱转移酶(chAT)明显低于其它各组,模型组酶(chAT)活性仅为正常组的24.10%,与文献报道的接近,治疗1组、治疗2组升高接近正常组,与文献报道相符合。由于乙酰胆碱递质合成减少,乙酰胆碱酯酶(AchE)活力也代偿性降低,模型组低于正常组及治疗组,在本实验得以证实。
3) 脑中铝Al3+造模已明显升高,但治疗组已明显下降. 铝可能是引起老年痴呆症的重要因素,文献中已有证明,本实验用中药排铝,已见明显下降。通过排铝的治疗组,记忆功能恢复。
4) 自由基( O 2 ˙ ¯ )浓度,谷胱甘肽,是反映体内抗氧能力的重要指标。自由基学说也是老年痴呆症发病的重要学说。有研究认为,大量的自由基在大脑中存在,促进了衰老过程,因此,清除自由基(
5) 血清谷丙转氨酶(ALT)、甘油三脂(TG)、总胆固醇(TC)、尿素氮含量,是反映肝、肾是否受损伤的重要代谢指标。
6) 水迷宫时间、错误率%、失败率%是测定小鼠记忆功能的常用指标。本实验表明,模型组水迷宫时间延长,错误率%、失败率%增加,治疗组下降,记忆功能恢复。
7) 老年痴呆症是世界医学界一大难题,发病率高,严重影响老年人生活质量,给家庭和社会都背上沉重的经济负担,它的病因与发病机理相当复杂,尚未阐明,也无根治药物,为此需深入研究,但又不能在病人身上进行研究,这是伦理不允许的。因此,在动物身上替代,复制人类疾病。
龙奇军,邓钰莹,谭川铃,邹 丹,许淑妹,田海潮,张树球,周国荃. 阿尔茨海默病模型小鼠脑乙酰胆碱转移酶(chAT)和乙酰胆碱酯酶(A-chE)活力的实验研究 Experimental Study on the Activity of Acetylcholinesterase (chAT) and Acetylcholinesterase (a-che) in the Brain of Rats with Alzheimer’s Disease[J]. 临床医学进展, 2019, 09(06): 807-814. https://doi.org/10.12677/ACM.2019.96124