目的:研究双肾草对COPD大鼠下丘脑–垂体–肾上腺轴(HPA轴)的调控,探讨其在COPD大鼠气道炎症治疗中的抗炎作用机理。方法:两次气管内注射脂多糖(LPS)及熏香烟法建立大鼠COPD模型。造模成功后按双肾草煎剂不同剂量灌胃,低剂量组(5 mg/kg);中剂量组(10 mg/kg);高剂量组(20 mg/kg)分别灌胃28天。用图像数据分析系统检测平均肺泡内衬间隔(MLI)及肺泡破坏指数(DI)。用Realtime-PCR检测大鼠肺组织中GRmRNA的含量、下丘脑中CRHmRNA及肾上腺中CORTmRNA的含量。结果:双肾草低、中、高剂量组和COPD模型组比较MLI及DI均有显著性差异(P < 0.01)。双肾草低、中、高剂量组和COPD模型组比较CRHmRNA、GCmRNA、CorTmRNA均明显升高(P < 0.05)。GR及CorTmRNA的表达随双肾草剂量的增加而增强,以双肾草高剂量组效果最佳。CRHmRNA的表达各剂量组之间比较无明显统计学差异(P > 0.05),但实验证明双肾草高剂量组效果优于其他剂量组。结论:双肾草煎剂能够有效的提高CRHmRNA、GRmRNA、CorTmRNA的含量,通过生物反馈效应,提高HPA轴的生物活性,刺激内源性激素的分泌,参与机体免疫,从而抑制COPD炎症反应。 Objective: To research the double kidney grass on COPD rats hypothalamus pituitary adrenal axis (HPA axis) control and discuss its anti-inflammatory action mechanism in the treatment of COPD airway inflammation. Methods: Two intratracheal injections of lipopolysaccharide (LPS) and cig-arette smoking were used to establish the COPD model in rats. After the model was successfully established, the rats were given different doses of double kidney grass decoction: low-dose group (5 mg/kg), medium-dose group (10 mg/kg, high-dose group (20 mg/kg) which were given gavage for 28 days. The mean alveolar lining interval (MLI) and alveolar destruction index (DI) were measured using an image data analysis system. The content of GRmRNA in lung tissues, CRHmRNA in hypothalamus and CORTmRNA in adrenal gland was detected by Realtime-PCR. Results: There were significant differences in MLI and DI between low, medium and high dose groups and COPD model group (P < 0.01). CRHmRNA, GCmRNA and CorTmRNA were significantly increased in the low, medium and high dose groups compared to the COPD model group (P < 0.05). The expression of GR and CorTmRNA increased with the increase of the dose of double kidney grass, and the effect was best in the high-dose double kidney grass group. CRHmRNA expression between each dose groups was no significant statistical difference (P > 0.05). But the experiment proved that the double kidney grass effect of high dose group is better than the other groups. Conclusion: Double kidney herb decoction can effectively improve CRHmRNA and CorTmRNA and GCmRNA levels, through the effect of biofeedback, to improve the biological activity of HPA axis, stimulating the secretion of endogenous hormones in the body's immune, thus inhibiting the COPD inflammation.
刘明慧1,周洵1*,李改改1,娄强1,李光文2,王美2
1贵州中医药大学第二附属医院,贵州 贵阳
2贵州中医药大学,贵州 贵阳
收稿日期:2019年7月11日;录用日期:2019年7月30日;发布日期:2019年8月6日
目的:研究双肾草对COPD大鼠下丘脑–垂体–肾上腺轴(HPA轴)的调控,探讨其在COPD大鼠气道炎症治疗中的抗炎作用机理。方法:两次气管内注射脂多糖(LPS)及熏香烟法建立大鼠COPD模型。造模成功后按双肾草煎剂不同剂量灌胃,低剂量组(5 mg/kg);中剂量组(10 mg/kg);高剂量组(20 mg/kg)分别灌胃28天。用图像数据分析系统检测平均肺泡内衬间隔(MLI)及肺泡破坏指数(DI)。用Realtime-PCR检测大鼠肺组织中GRmRNA的含量、下丘脑中CRHmRNA及肾上腺中CORTmRNA的含量。结果:双肾草低、中、高剂量组和COPD模型组比较MLI及DI均有显著性差异(P < 0.01)。双肾草低、中、高剂量组和COPD模型组比较CRHmRNA、GCmRNA、CorTmRNA均明显升高(P < 0.05)。GR及CorTmRNA的表达随双肾草剂量的增加而增强,以双肾草高剂量组效果最佳。CRHmRNA的表达各剂量组之间比较无明显统计学差异(P > 0.05),但实验证明双肾草高剂量组效果优于其他剂量组。结论:双肾草煎剂能够有效的提高CRHmRNA、GRmRNA、CorTmRNA的含量,通过生物反馈效应,提高HPA轴的生物活性,刺激内源性激素的分泌,参与机体免疫,从而抑制COPD炎症反应。
关键词 :双肾草,COPD,HPA轴,炎症机制
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慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)是一组以不完全可逆气流受限为特征的疾病,气流受限常呈进行性发展,但是可以预防和治疗的疾病。其发病率呈现逐年上升的趋势 [
健康SD雄性清洁级大鼠40只,由重庆滕鑫公司提供,合格证号:SCXK(渝)2012-0005。鼠龄为20周,体重为220 g ± 40 g,饲养室内温度15℃ ± 5℃,湿度为40%~60%,每组大鼠单笼喂养。
双肾草(贵州永博鑫公司),红河香烟(云南红云红河烟草(集团)有限公司:84 mm烤烟型,焦油含量11 mg,烟气烟碱含量1.0 mg,烟气一氧化碳含量11 mg),脂多糖(10 mg) (美国Segma公司),粘附载玻片(HEHYGLASS福州迈新);预染蛋白分子量标准(Marker)由碧云天生物技术公司(上海)提供;Trizol试剂(北京康润诚业生物有限公司);SYBR®OR Green PCR Master mix、CDNA第一链合成试剂盒(北京康润诚业生物有限公司);DL2000 DNA Marker (TAKARA-3427A)。
40只大鼠造COPD模型,分装大鼠置于鼠笼,每日将大鼠转置于熏烟箱内。云南产“红河”香烟10支(84 mm烤烟型,焦油含量11 mg,烟气烟碱含量1.0 mg,烟气一氧化碳含量11 mg)。将大鼠持续暴露于烟雾中30 min/次,2次/d,(每次10支烟),上午与晚上各一次,每次间隔6~8小时,每周进行6天,连续12周。在动物购入后的第2天及第15天分别行脂多糖气管内注射 [
模型组及双肾草低、中、高剂量组,取右肺组织,石蜡包埋切片,HE染色,每张片随机选取5个视野(尽量避开大血管及支气管区域),观察肺组织病理形态,采用病理图像分析仪HPIAS-1000 (武汉清平影像技术有限责任公司)观察平均肺泡内衬间隔(MLI)及肺泡破坏指数(DI)。
采用RT-PCR检测方法。将麻醉处死后的大鼠立即开胸取肺组织、开腹取肾上腺。断头,去除颅顶骨块,完整取出脑组织,锐性切取下丘脑。各组大鼠的肺组织、下丘脑、肾上腺置入去酶的冷冻管中,放置于−80℃低温冰箱中保存,用液氮进行运输。用Realtime-PCR检测肺组织中GRmRNA的含量,下丘脑中CRHmRNA的含量,以及肾上腺中CorTmRNA的含量。基因GR引物序列F:5-CCTCCCATTCTAACCATCCT-3 (上游) R: 5-CTCCCTCTGCTAACCTGTG-3 (下游) 175 bp;CRH F: 5-CAGCCGTTGAATTTCTTGCA-3 (上游) R: 5-CCAGGCGGAGGAAGTATTCTT-3 (下游) 88 bp;CorT F: 5-CTTCAGGTCTCCAAGGAGGATG-3 (上游) R: 5-GAGAGCAGCAGCAGCAGCA-3 (下游) 87 bp;GAPDH F: 5-GGCAAGTTCAATGGCACAGT-3 (上游) R: 5-TGGTGAAGACGCCAGTAGACTC-3 (下游) 151 bp;以上引物由TaKaRa公司设计和合成;在PCR仪上按以下条件进行反转录反应:42℃ 50 min,70℃ 15 min,取出反应体系,立刻进行实验或者-20度冰箱保存待用。PCR反应条件,94℃ 2 min;94℃ 30 s;55℃~65℃ 30 s;72℃ 30 s于PCR扩增仪(杭州大河热毯电子有限公司)上进行扩增,共40个循环,将产物经琼脂胶糖电泳,采用凝胶成像分析系统GDS8000 (英国UVP公司)进行分析。以目的基因与GAPDH条带灰度值的比值为该目的基因的相对含量。
选用SPSS 20.0统计分析软件进行数据的分析处理。全部数据用mean ± SEM表示;组间对比采用Analyze-one-way-ANOVA (单因素方差分析)。P < 0.05为有统计学意义,P < 0.01为具有显著性差异。
造模进行第12周时,所有大鼠均表现有不同程度的体重减轻、饮食减少、气喘、活动减少,活动后喘促、张口呼吸、对外界刺激反应较迟钝、弓背蜷缩,喜扎堆,畏寒喜暖;体毛枯疏,失去光泽,竖毛等征象。
组织摘除后可见两肺外观膨胀,体积明显增大,弹性差,肺组织表明不平整,部分可与组织粘连,切面可见多量较大的肺泡腔,部分肺泡呈现多个联合,大小形状不等。
COPD模型组:COPD组大鼠气管管腔显著增厚,管腔内径缩小;部分管腔伴粘液栓形成及组织增生;各级支气管壁、周围肺组织伴大量炎性细胞浸润。肺泡壁变薄,肺泡腔扩大,部分泡壁损坏,融合形成肺大泡,肺泡数目显著减少,见图1。
双肾草低剂量组:与COPD模型组相比,未见明显改变,肺泡壁变薄,肺泡腔扩大,肺泡壁损坏后出现肺泡腔融合,见图1。
双肾草中、高剂量组:管腔增厚情况减轻,纤维组织增生减轻,周围肺组织炎性细胞浸润减轻,肺泡破坏数量减少,见图1。
图1. 光镜下肺组织病理切片(10 × 20)
通过光学显微镜及图像数据分析系统计算出平均肺泡内衬间隔(MLI)及肺泡破坏指数(DI)。
双肾草低、中、高剂量组均能较COPD模型组明显减小平均肺泡内衬间隔及降低肺泡破坏指数。
MLI统计分析:双肾草低、中、高剂量组和COPD模型组比较均有显著性差异(P < 0.01)。双低组和COPD模型组比较P = 0.006,双中组和COPD模型组比较P = 0.003,双高组和COPD模型组比较P = 0.000;双肾草低剂量组与双肾草中、高剂量组对比均无统计学意义(P > 0.05),其中双低组和双中组比较P = 0.756,双低组和双高组比较P = 0.257;双肾草中剂量组与双肾草高剂量组比较无统计学意义P = 0.405 (P > 0.05)。
DI统计分析:双肾草低、中、高剂量组和COPD模型组比较均有显著性差异(P < 0.01)。双低组和COPD模型组比较P = 0.000,双中组和COPD模型组比较P = 0.000,双高组和COPD模型组比较P = 0.000;双肾草低剂量组与双肾草中、高剂量组对比均无统计学意义(P > 0.05),其中双低组和双中组比较P = 0.537,双低组和双高组比较P = 0.291;双肾草中剂量组与双肾草高剂量组比较无统计学意义P = 0.653 (P > 0.05)。
实验说明:双肾草煎剂治疗均能降低MLI和DI,能有效的改善肺组织结构完整,抑制肺泡腔扩大,但其改善作用不随药物剂量的增加而变化(无统计学意义),见表1。
组别 | n | MLI (µm) | DI (%) |
---|---|---|---|
COPD模型组 | 6 | 3.6960 ± 0.14442 | 56.0320 ± 3.40931 |
双肾草低剂量组 | 6 | 3.0360 ± 0.04717△ | 40.5280 ± 1.93150△ |
双肾草中剂量组 | 6 | 3.0800 ± 0.27379△ | 38.5600 ± 2.36379△ |
双肾草高剂量组 | 6 | 2.6960 ± 0.15902△ | 36.7720 ± 1.95643△ |
表1. 各组大鼠肺组织MLI及DI (mean ± s)
与COPD模型组比较,△P < 0.01。
GRmRNA统计分析:双肾草低剂量组和COPD模型组比较有统计学差异P = 0.04 (P < 0.05),双肾草中剂量组和COPD模型组比较有显著性差异P = 0.001 (P < 0.01);双肾草高剂量组和COPD模型组比较有显著性差异P = 0.000 (P < 0.01)。双肾草低剂量组和双肾草中剂量组比较无差异P = 0.112 (P > 0.05);双肾草低剂量组和高剂量组比较有显著性差异P = 0.001 (P < 0.01);双肾草中剂量组和高剂量组比较有差异P = 0.042 (P < 0.05)。说明双肾草干预的剂量组均能提高肺组织中GRmRNA的表达。其中,双肾草煎剂的治疗效果随剂量的增加而增强,以双肾草高剂量组效果最佳,见表2。
CorTmRNA统计分析:双肾草低剂量组和COPD模型组比较具有显著性差异P = 0.001 (P < 0.01),双肾草中、高剂量组和COPD模型组比较均有显著性差异P = 0.000 (P < 0.01);双肾草低剂量组和双肾草中、高剂量组均有显著性差异P = 0.000 (P < 0.01);双肾草中、高剂量组之间比较有差异P = 0.045 (P < 0.05)说明双肾草各剂量组在干预COPD模型大鼠肾上腺中CorTmRNA表达过程中,均具有显著的提高作用,其作用随双肾草剂量的增加而增强,见表2。
CRHmRNA统计分析:双肾草低剂量组和COPD模型组比较具有统计学差异P = 0.012 (P < 0.05),双肾草中剂量组和COPD模型组比较具有显著性差异P = 0.001 (P < 0.01);双肾草高剂量组和COPD模型组比较有显著性差异P = 0.000 (P < 0.01)。双肾草低剂量组和双肾草中剂量组比较无统计学差异P = 0.331 (P > 0.05),双肾草低剂量组和双肾草高剂量组比较有统计学差异P = 0.011 (P > 0.01)。双肾草中、高剂量组比较P = 0.087 (P > 0.05)。说明双肾草各剂量组能显著的增强大鼠下丘脑中CRHmRNA的表达。其中各剂量组之间比较无明显统计学差异,但实验证明双肾草高剂量组效果优于其他剂量组,见表2。
组别 | GRmRNA | CRHmRNA | CORTmRNA |
---|---|---|---|
模型组 | 23.4133 ± 0.48237 | 11.1267 ± 0.51749 | 4.9533 ± 0.10689 |
双低组 | 25.4767 ± 0.83032● | 12.8767 ± 0.44040▲ | 6.2850 ± 0.31965● |
双中组 | 27.0367 ± 0.51104▲ | 13.5083 ± 0.54071▲◆ | 7.7900 ± 0.24771▲ |
双高组 | 29.0767 ± 0.76175▲◆ | 14.6500 ± 0.22033▲◆ | 8.5383 ± 0.26493▲◆ |
表2. 各组大鼠肺组织中GRmRNA、下丘脑中CRHmRNA和肾上腺中CORTmRNA含量(mean ± SEM)
与模型组比较,●P < 0.05,▲P < 0.01;与双肾草低剂量组比较▲◆P < 0.01;与双肾草中剂量组比较▲◆P < 0.05。
COPD的发病机制至今尚无定论,目前普遍认为气道炎症在COPD的发病机制中起着至关重要的作用,气道炎症诱发COPD的机制可能是因为有害气体侵袭气道,导致炎症因子发生一系列的炎性反应及病理性改变,形成多个致病因子共同参与的炎性叠加,造成气道、肺组织炎性水肿、病理性增生,诱发气道重塑,出现气流受限并呈现进行性发展。其中炎症因子同时又引发神经内分泌系统发生病理性改变,主要是HPA轴功能下降,导致自身调节功能失衡,引起机体的一系列免疫反应。现代研究显示COPD患者急性发作期和稳定期存在着一定程度的HPA轴的功能低下,这与老龄患者肾上腺皮质功能衰退,HPA轴及免疫调节功能下降,呼吸道防御能力减弱,单核–吞噬细胞系统功能退化密切相关 [
1) DCN对COPD大鼠气道重塑信号传导通路的干预及苗药对其影响项目编号:贵州省科技厅立项资助(黔科合SY字(2013)3071号).
2) 补肾苗药双肾草通过HPA轴调控COPD大鼠气道炎症的机制研究项目编号:贵州省卫生厅立项资助(黔省专合字(2012)189号)。
刘明慧,周 洵,李改改,娄 强,李光文,王 美. 苗药双肾草通过HPA轴调控COPD气道炎症机制的研究 The Research of Miao Medicine Double Kidney Grass Regulation Mechanism of COPD Airway Inflammation through HPA Axis[J]. 临床医学进展, 2019, 09(08): 919-925. https://doi.org/10.12677/ACM.2019.98141