利用核桃青皮组织的乙醇粗提取物对苹果轮纹病菌和桃褐腐病菌的生长抑制效果进行测定。将核桃青皮组织的乙醇提取物稀释10倍,100倍和1000倍,分别测定不同稀释液的抑菌效果,结果表明,10倍稀释提取物的抑菌效果最为显著,10倍和100倍液之间具有极显著差异(P < 0.01),100倍和1000倍倍液之间在0.01水平和0.05水平上无显著差异(P > 0.05)。取10倍乙醇提取物处理菌液2小时,对菌液中的过氧化氢酶的活性进行鉴定,结果表明核桃青皮提取物对病菌的抗逆性有一定限制,抑制了细胞酶的活性。 This research aims to determine the antibacterial effect of the acoholic extract from walnut geen pel. We used Physalospora nasei and Monilinia fructicola to do this study. The acoholic extracts were diluted 10, 100 and 1000 times respectively to determine the antibacterial effect, the results showed that ten times dilution has the significant bacteriostatic effects on Physalospora nasei and Monilinia fructicola, and there were no significant differences between 100 times and 1000 times dilutions at 0.01 level and 0.05 level. Then we continued to use the ten times dilution to deal with the two bacterial solutions to test the catalase activity in the solution, the extract had been proved to have inhibitory effect on catalase activity.
张黎丽,杜安琪,王欣艺,李金宝,于海洋,刘祎良,周敏,孔心茹,徐娜
济宁医学院生物科学学院,山东 日照
收稿日期:2019年10月8日;录用日期:2019年10月23日;发布日期:2019年10月30日
利用核桃青皮组织的乙醇粗提取物对苹果轮纹病菌和桃褐腐病菌的生长抑制效果进行测定。将核桃青皮组织的乙醇提取物稀释10倍,100倍和1000倍,分别测定不同稀释液的抑菌效果,结果表明,10倍稀释提取物的抑菌效果最为显著,10倍和100倍液之间具有极显著差异(P < 0.01),100倍和1000倍倍液之间在0.01水平和0.05水平上无显著差异(P > 0.05)。取10倍乙醇提取物处理菌液2小时,对菌液中的过氧化氢酶的活性进行鉴定,结果表明核桃青皮提取物对病菌的抗逆性有一定限制,抑制了细胞酶的活性。
关键词 :核桃青皮,乙醇提取,抑菌测定,过氧化氢酶
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核桃(Juglans regia Linn)又称胡桃、羌桃,是胡桃科植物,胡桃科核桃属落叶乔木,是核桃属植物中经济价值最高的一种,在中国进行栽种的历史悠久,种植资源丰富,在我国新疆,山东,云南等省份都普遍种植,截止到2004年,全国核桃树的栽培面积约91.75 hm2,种植颗数在2亿株左右,面积和数量均居世界第一位。为了充分利用核桃青皮这一资源,已有学者对核桃青皮提取物的除草、杀虫以及抗病毒等农药活性做了研究 [
核桃青皮(采自沂蒙山区核桃树);100%无水乙醇(分析纯)、PDA培养基。供试菌种苹果轮纹病菌(Physalospora nasei)桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)种病原菌由植物病理实验室提供。
PDA培养基:200 g土豆,20 g葡萄糖,20 g琼脂,1000 ml水。
首先洗净去皮马铃薯,然后将其切碎,加水1000 ml煮沸半小时,用纱布将马铃薯滤掉,将其滤液加水补足到1000 ml,然后加琼脂和葡萄糖,然后加热使琼脂完全熔化后,趁热用纱布过滤掉滤渣,然后分装三角瓶,加棉塞,121℃,高压灭菌20 min。
核桃青皮干粉和无水乙醇按1:10比例混合,先称取200 g,合并萃取液三次,并在过滤后,将滤液浓缩在电动恒温水浴中以得到粗提取物,即核桃剥离,将其放置在一个灭菌的烧瓶加盖并预留的粗提取物。
定量培养基的制备:严格量取27 ml液体PDA培养基及0.54 g琼脂粉装于三角瓶中,封口,121℃,灭菌20 min。
含有提取物的培养基制备:加热并熔化定量培养基,将其冷却至50℃~55℃,加入3 ml原浓缩液和10倍、100倍稀释液,并加少量链霉素抑制细菌生长,充分摇匀后迅速倒入3个培养皿中,浓度恰好是上述浓缩液和稀释液的十分之一,即得到提取物稀释10倍、100倍、1000倍的培养基,等到凝固后,标记各培养皿提取物的浓度,对照组的培养基加3 ml的无菌水 [
菌饼的制备:待分离鉴定的菌种的培养需要在25℃恒温条件下进行,等到菌丝长到培养基的2/3时,再用直径0.7 cm打孔器在菌落的边缘打取菌块,即为接种用的菌饼。
菌饼的接种与培养:培养基凝固后,将菌饼接种到培养皿,并且滤饼加入到各培养皿,在恒温培养箱中培养,观察其生长情况,测量菌落的直径。
菌落直径的测定:3株菌培养3、5、7 d,用“十”字交叉法测量三组菌落的增长直径,分别测量每个菌落的最大和最小直径,取其平均值,然后减去接种菌饼的直径,即为菌落直径。
参考蔡庆生 [
抑制生长率(%) = [(对照菌落平均直径-处理菌落平均直径)/对照菌落平均直径] × 100 [
数据处理采用SPSS 21.0对实验结果进行统计分析,多组间比较采用单因素方差分析。
将乙醇提取物分别稀释10倍、100倍、1000倍后,再对抑制效果进行统计,结果如表1所示。
稀释倍数 | 3d | 抑菌率(%) | 5d | 抑菌率(%) | 7d | 抑菌率(%) |
---|---|---|---|---|---|---|
直径/cm | 直径/cm | 直径/cm | ||||
10 | 0.03 | 98.92aA | 0.05 | 98.43aA | 0.12 | 97.90aA |
100 | 2.30 | 17.86bB | 2.37 | 25.93bB | 5.17 | 9.77bB |
1000 | 2.37 | 15.36bB | 2.67 | 16.56bB | 5.33 | 6.98bB |
CK | 2.80 | / | 3.20 | / | 5.73 | / |
表1. 不同浓度乙醇提取物对苹果轮纹病菌的抑菌效果
*说明:不同小写字母表示处理间0.05水平上差异显著(P < 0.05);不同大写字母表示0.01水平上差异极显著(P < 0.01)。
对表1分析可得出,乙醇提取物在稀释10倍时抑菌效果均为100%,稀释100倍和1000倍后,抑菌效果显著降低。10倍和100倍液之间具有差异极显著,100倍和1000倍倍液之间在0.01水平和0.05水平上无显著差异。
桃褐腐病菌经过不同浓度乙醇提取物处理后,连续培养,期间测定其抑菌直径,结果见表2。
稀释倍数 | 3d | 抑菌率(%) | 5d | 抑菌率(%) | 7d | 抑菌率(%) |
---|---|---|---|---|---|---|
直径/cm | 直/cm | 直径/cm | ||||
10 | 0.09 | 97.35aA | 0.19 | 96.92aA | 0.24 | 96.87aA |
100 | 2.37 | 30.29bB | 5.07 | 17.82bB | 6.33 | 20.08bB |
1000 | 2.93 | 13.82bB | 5.70 | 7.61bB | 6.63 | 15.59bB |
CK | 3.40 | / | 6.17 | / | 7.67 | / |
表2. 不同浓度乙醇提取物对桃褐腐病菌的抑菌效果
*说明:不同小写字母表示处理间0.05水平上差异显著(P < 0.05);不同大写字母表示0.01水平上差异极显著(P < 0.01)。
表2结果表明,10倍和100倍液、1000倍液之间具有差异极显著,100倍和1000倍倍液之间无显著差异性,且乙醇提取物的抑菌率基本是随浓度的降低而降低。
从表1和表2可以看出,核桃青皮乙醇提取物在稀释10倍时抑菌效果最好。因为微生物在受到外界迫害时会产生过氧化氢,过氧化氢酶是一种酶类清除剂,它可以促进过氧化氢酶分解为分子氧和水,清除体内的过氧化氢,从而使细胞免于过氧化氢毒害,因而,过氧化氢酶活性值的检测可以作为微生物防御功能的重要指标之一。我们在培养的菌液中加入10倍乙醇提取物处理2小时,来检测两种菌液中的过氧化氢酶的活性,结果如表3所示。
苹果轮纹病菌 | 桃褐腐病菌 | 空白对照 | |
---|---|---|---|
过氧化氢酶活性值 | 4.56 | 3.46 | 22.468 |
表3. 10倍乙醇提取物处理后两株菌的过氧化氢酶活性
表3结果表明,核桃青皮提取物对病菌的抗逆性有一定限制,抑制了酶的活性。
据文献报道,核桃和同属植物核桃富含次生物质,包括酚类,黄酮类,香豆素类,木质素类,生物碱,糖苷和有机酸等 [
山东省自然科学基金(ZR2017BC081),国家重点实验室开放项目(2017KF08),大学生创新训练计划(cx2019096),大学生创新训练计划(cx2019044)。
张黎丽,杜安琪,王欣艺,李金宝,于海洋,刘祎良,周 敏,孔心茹,徐 娜. 核桃青皮乙醇提取物的抑菌效果测定The Antibacterial Effect of the Alcoholic Extract from Walnut Green Peel[J]. 农业科学, 2019, 09(10): 980-984. https://doi.org/10.12677/HJAS.2019.910137