通过对毛建草叶片产生愈伤组织的培养、不定芽的诱导及组培苗再生的研究,建立了培养周期短、再生效率高的民毛建草再生体系。利用多因子正交实验设计及分析,筛选出最佳愈伤组织诱导培养基是MS + 1.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L 2,4-D + 0.2 mg/L IAA。通过比较细胞分裂素6-BA、KT和TDZ对诱导愈伤组织分化不定芽的效果,发现最适的不定芽再生培养基为MS + 0.5 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L TDZ + 0.1 mg/L IBA。最后,MS培养基添加0.1 mg/L NAA能有效地使再生苗产生根系,效率达70%以上。<br/>Through the study of callus culture, adventitious bud induction and tissue culture seedling rege-neration from the leaves of Tibetan medicine Dracocephalum rupestre, the regeneration system with short culture cycle and high regeneration efficiency was developed. The design and analysis of multivariate experiments showed the optimum medium for callus induction was MS + 1.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L 2,4-D + 0.2 mg/L IAA. By comparing the effects of cytokinin 6-BA, KT and TDZ on induction of adventitious bud differentiation, it was found that the optimum medium for adventitious bud regeneration was MS + 0.5 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L TDZ + 0.1 mg/L IBA. Finally, adding 0.1 mg/L NAA to MS medium could effectively make regenerated seedlings produce roots, and the efficiency was more than 70%.
张国珍1,2*,时小东2*,韩攀3*,代庭伟3,谢洁4,秦小波1,2,3#,牛蓓2#,樊莉娟1,3,王菲3
1四川省自然资源科学研究院,四川 成都
2成都大学农业农村部杂粮加工重点实验室,四川 成都
3四川大学生命科学学院,生物资源与生态环境教育部重点实验室,四川 成都
4四川师范大学生命科学学院,四川 成都
收稿日期:2019年10月28日;录用日期:2019年11月22日;发布日期:2019年11月29日
通过对毛建草叶片产生愈伤组织的培养、不定芽的诱导及组培苗再生的研究,建立了培养周期短、再生效率高的民毛建草再生体系。利用多因子正交实验设计及分析,筛选出最佳愈伤组织诱导培养基是MS + 1.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L 2,4-D + 0.2 mg/L IAA。通过比较细胞分裂素6-BA、KT和TDZ对诱导愈伤组织分化不定芽的效果,发现最适的不定芽再生培养基为MS + 0.5 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L TDZ + 0.1 mg/L IBA。最后,MS培养基添加0.1 mg/L NAA能有效地使再生苗产生根系,效率达70%以上。
关键词 :毛建草,愈伤组织,再生,植物生长激素
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毛建草(Dracocephalum rupestre Hance),作为唇形科(Labiatae)青兰属植物,多年生草本,具有典型的青兰属植物特征。其茎带紫色,叶三角状卵形,基部心形,具圆齿。轮伞花序密集成头状,稀穗状。花萼、花冠紫蓝色。主要分布于辽宁及华北、西北等地海拔650~2 400 m (川西北、青海省达3 100 m)的高山草原、草坡或疏林下岩石裂隙中,在内蒙古自治区主要分布于包头市九峰山阴山山脉,是良好的野生种质资源 [
毛建草具有独特药用功效,同时也是一种制茶原料,野生资源过度开采导致毛建草资源匮乏,濒临灭绝 [
试验所需植物材料来源于四川、青海等地,经鉴定为唇形科(Labiatae)青兰属植物毛建草(Dracocephalum rupestre Hance)。
叶片用清水冲洗干净,再用70% (V/V)酒精浸泡15 s,用无菌水清洗3次,然后放入0.5%的氯化汞(HgCl2)溶液浸泡3 min,最后用无菌水冲洗干净。
将无菌的叶片切成1 cm2的小块,块中可带有中脉或是叶缘,接入愈伤组织诱导培养基。愈伤组织诱导培养基配方为如下:MS [
将诱导出的愈伤组织接种到含有生长素IBA(0.1 mg/L)的再生培养基上,再生培养基中的细胞分裂素(CTK)为0.05~0.5 mg/L TDZ或0.1~1.0 mg/L KT 或0.1~1.0 mg/L 6-BA,或是2种CTK的组合(表3)。再生培养基附加有3%蔗糖、0.7%琼脂粉,pH = 5.8,室温26℃,光周期16 h/8 h,光照强度为2000 Lx。20个愈伤一个处理,3次重复,1月后统计不定芽数量。
不定芽达2~3 cm后,转移至生根培养基,生根培养基配方为MS + 0.05~0.4 mg/L NAA或MS + 0.05~0.4 mg/L IBA,筛选出最佳生根培养基后,向其中添加预实验确定的浓度0.1%(w)活性炭,比较活性炭对生根的影响。20个不定芽一个处理,2次重复,1个月后统计生根情况。
揭开三角瓶封口膜,将生根的再生苗继续置于温室中培养1周。为避免培养基蒸腾失水,需不定时向培养基加水。然后小心取出生根苗,洗去依附于苗上的培养基,将其移植于培养钵中,基质为珍珠岩: 沙:营养土 = 1:1:1 (V/V/V),置于温室内,用水浇透。待生根苗存活后,再移出温室。
愈伤组织诱导率 = (愈伤组织块数/接种外植体数) × 100%
不定芽分化率 = (分化不定芽的愈伤组织块数/接种外植体数) × 100%
生根率 = (生根的不定芽数/接种的不定芽数) × 100%
对计算结果用SPSS软件进行差异显著性分析(邓肯氏最小显著差数测验)。
将叶片接种到愈伤组织诱导培养基后,7 d内就会产生愈伤组织。表1显示,6-BA是诱导毛建草叶片产生愈伤组织的关键植物生长调节剂,培养基中添加6-BA,可顺利诱导叶片出愈。随着6-BA浓度的升高,叶片出愈率随之升高,但愈伤组织的质地变得松散。浓度1.0 mg/L的6-BA能诱导80.77% ± 2.2%的叶片产生瘤状愈伤组织,2.0 mg/L的6-BA虽然也能诱导愈伤组织大量产生,但愈伤组织质地疏松,瘤状结构稀少,再生能力差。添加2,4-D及IAA后发现,浓度0.2 mg/L的2,4-D与浓度0.2 mg/L的IAA组合对毛建草叶片形成愈伤有促进作用。1.0 mg/L 6-BA与0.2 mg/L 2,4-D及0.2 mg/L IAA的组合对诱导毛建草叶片产生瘤状愈伤组织的效果最佳,诱导率高达92.75% ± 2.1% (图1(a))。
激素浓度/ mg∙L−1 Concentration of PGRs (mg∙L−1) | 出愈率/% Callus induction rate(r/%) | 愈伤组织形态 Morphology of callus | ||
---|---|---|---|---|
6-BA | 2,4-D | IAA | ||
0.5 | 0 | 0 | 65.24 ± 4.0b | 紧实,瘤状结构少 |
1.0 | 0 | 0 | 80.77 ± 2.2a | 紧实,瘤状结构多 |
2.0 | 0 | 0 | 84.51 ± 4.2a | 疏松,瘤状结构少 |
0.5 | 0.1 | 0.1 | 66.29 ± 1.3b | 紧实,瘤状结构少 |
1.0 | 0.2 | 0.2 | 92.75 ± 2.1a | 紧实,瘤状结构多 |
2.0 | 0.5 | 0.5 | 76.45 ± 1.9a | 疏松,瘤状结构少 |
0.5 | 0.5 | 0.5 | 63.07 ± 1.5b | 紧实,瘤状结构少 |
1.0 | 0.1 | 0.1 | 82.36 ± 2.2a | 紧实,瘤状结构多 |
2.0 | 0.2 | 0.2 | 77.05 ± 2.0a | 疏松,瘤状结构少 |
0.5 | 0.2 | 0.2 | 69.12 ± 1.3b | 紧实,瘤状结构少 |
1.0 | 0.5 | 0.5 | 79.05 ± 2.0a | 紧实,瘤状结构多 |
2.0 | 0.1 | 0.1 | 74.54 ± 1.8a | 疏松,瘤状结构少 |
0.5 | 0.1 | 0.5 | 68.14 ± 1.6b | 紧实,瘤状结构少 |
1.0 | 0.2 | 0.1 | 88.25 ± 2.2a | 紧实,瘤状结构多 |
2.0 | 0.5 | 0.2 | 70.85 ± 2.0a | 疏松,瘤状结构少 |
表1. 植物生长调节剂对毛建草叶片愈伤组织诱导的影响
The different letters in the same column mean the significant difference (P ≤ 0.05) by Duncan’s LSD Test. The same below.
表中不同字母表示邓肯氏最小显著差数测验差异显著(P ≤ 0.05)。下同。
外植体分别进行光培养与暗培养20 d,观察发现光培养与暗培养均能诱导愈伤组织形成。暗培养产生的愈伤组织出现早,平均7 d就能观察到愈伤产生,且体积大、质地松散、无法分化,须在光下培养2 周,并转绿后才能恢复分化能力。光培养条件下,至少5 d后才有愈伤组织生成,但愈伤组织颜色墨绿,质地紧密,瘤状结构明显;15 d后即可转入分化培养基,15 d内就能产生不定芽。
多次继代培养会使愈伤组织的结构和颜色发生明显变化(图1)。表2显示,随着继代次数的增加,愈伤组织逐渐失绿褐化,增殖能力下降,质地变得松散,瘤状结构消失,不定芽再生率也随之下降。特别是第4次继代后,愈伤组织严重褐化,产生不定芽的能力下降明显。
图1. 毛建草叶片愈伤组织。(a) 叶片接种于最佳愈伤组织诱导培养基的瘤状愈伤组织;b) 经历了4次继代培养的愈伤组织出现褐化现象,瘤状结构消失;c) 经历了1次继代培养的愈伤组织)
继代次数 Subculture times | 愈伤组织形态 Morphology of callus | 不定芽再生率/% Frequency of adventitious shoot formation (r/%) |
---|---|---|
1 | 绿白色,瘤状结构丰富 | 75.58 ± 8.8a |
2 | 绿白色,瘤状结构丰富 | 69.82 ± 4.9a |
3 | 绿白色,较少瘤状结构 | 61.79 ± 2.5ab |
4 | 黄绿色,较少瘤状结构 | 49.15 ± 2.8b |
5 | 黄绿色,松散 | 27.65 ± 5.4c |
6 | 褐色,松散 | 19.94 ± 3.6c |
表2. 继代次数对愈伤组织形成和分化的影响
诱导不定芽再生的实验发现,3种细胞分裂素(CTK)单一添加时,随着CTK浓度增加,不定芽再生率均呈现先增后降的趋势(表3)。其中,6-BA效果最好,TDZ其次,KT最差。6-BA的最佳浓度为0.5 mg/L,不定芽再生率高达64.17% ± 3.8%,每个愈伤组织平均产生4.06个芽。TDZ的最佳浓度为0.5 mg/L,不定芽再生率为60.85% ± 3.7%,但诱导的芽玻璃化现象严重,生长缓慢且基部产生较多愈伤组织;继续培养15 d后,愈伤组织生长过盛,抑制了不定芽的伸长生长,最后导致不定芽生长不良而死亡。3种CTK最佳浓度的两两组合发现,6-BA与TDZ组合的效果最好,诱导不定芽再生率最高,达72.54% ± 2.8%,不定芽数量多且健壮。同时,KT+6-BA和KT+TDZ的组合对不定芽诱导具有负作用,诱导效果不如单一添加6-BA或TDZ。因此,不定芽再生的最佳培养基为:MS + 0.5 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L TDZ + 0.1 mg/L IBA。将愈伤组织接种到最佳不定芽再生培养基上7~15 d可出现不定芽,继续培养7~15 d不定芽可伸长至2~3 cm。
细胞分裂素/mg∙L−1 Concentration of CTK | 不定芽再生率/% Frequency of shoot formation (r/%) | 每愈伤组织产生的平均芽数/个 Number of shoots | ||
---|---|---|---|---|
6-BA | KIN | TDZ | ||
0.1 | 0 | 0 | 16.24 ± 3.1d | 1.25d |
0.5 | 0 | 0 | 64.17 ± 3.8a | 4.06a |
1.0 | 0 | 0 | 51.06 ± 4.2b | 3.56ab |
0 | 0.1 | 0 | 10.55 ± 2.8d | 0.88d |
0 | 0.5 | 0 | 36.92 ± 3.4c | 2.72bc |
0 | 1.0 | 0 | 31.75 ± 1.9c | 2.45bc |
0 | 0 | 0.05 | 37.21 ± 1.7bc | 1.36d |
0 | 0 | 0.1 | 40.95 ± 2.4bc | 2.71bc |
0 | 0 | 0.5 | 60.85 ± 3.5a | 3.65a |
0.5 | 0.5 | 0 | 43.51 ± 5.5bc | 2.44bc |
0.5 | 0 | 0.1 | 72.54 ± 2.8a | 4.20a |
0 | 0.5 | 0.1 | 33.06 ± 2.5c | 1.68cd |
表3. 细胞分裂素对愈伤组织分化不定芽的影响
诱导植株生根的常用生长素有NAA和IBA等,通过比较不同浓度的NAA和IBA对毛建草再生苗生根的影响(表4),发现MS培养基中添加0.1 mg/L或0.2 mg/L的IBA和添加0.1 mg/L NAA均能使69%以上的再生苗在7 d内产生根系,15 d内可移栽。其中,0.1 mg/L NAA能最早的诱导根系萌动,平均5 d就有根系出现,为最佳生根培养基。而浓度达0.4 mg/L的IBA和NAA仍能诱导根系产生,但在根系与茎干的结合处会产生大量的愈伤,且其旺盛生长反而抑制根系生长。移栽试验显示,根系与茎干结合处有大量愈伤组织的生根苗存活率极低。添加0.1%的活性炭于生根培养基,虽不能影响生根率和平均根数,但能有效促进根系生长粗壮。
激素浓度/ mg∙L−1 Concentration of PGRs (mg∙L−1) | 生根率/% Rooting percentage (r/%) | |
---|---|---|
NAA | IBA | |
0.05 | 0 | 33.74 ± 2.0d |
0.1 | 0 | 77.82 ± 2.5a |
0.2 | 0 | 51.65 ± 2.3b |
0.4 | 0 | 47.25 ± 2.1e |
0 | 0.05 | 45.06 ± 2.1bc |
0 | 0.1 | 73.14 ± 2.9a |
0 | 0.2 | 69.51 ± 2.1a |
0 | 0.4 | 41.95 ± 2.6bc |
表4. NAA和IBA对再生苗生根的影响
本研究建立了毛建草叶片离体组织再生体系,50天内可完成从叶片培养到再生苗移栽整个过程。叶片再生率高达67.28% ± 2.6%,每个愈伤组织平均产生约4个芽。毛建草叶片产生瘤状愈伤组织的最佳培养基是MS + 1.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L 2,4-D + 0.2 mg/L IAA。不定芽再生的最佳培养基是MS + 0.5 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L TDZ + 0.1 mg/L IBA。最佳生根培养基为MS + 0.1 mg/L NAA。
虽然多数植物采用茎尖和茎段作为组培快繁的外植体,从而能够较容易地诱导再生芽 [
试验发现,毛建草叶片产生的愈伤组织继代培养多次后,会逐渐丧失分化能力。也有报导显示,愈伤组织继代培养需要针对性的培养基 [
四川省科技计划项目(2018NZ0091、2019YFS0107)、四川省级公益性科研院所基本科研业务费项目、农业农村部杂粮加工重点实验室开放基金资助(No.2018CC12)、四川省中医药管理局科研项目(2018KF007)共同资助。
张国珍,时小东,韩 攀,代庭伟,谢 洁,秦小波,牛 蓓,樊莉娟,王菲. 毛建草愈伤组织诱导与离体组织再生繁育研究Study on Callus Induction and Tissue Culture Regeneration In Vitro of Dracocephalum rupestre[J]. 植物学研究, 2019, 08(06): 525-532. https://doi.org/10.12677/BR.2019.86066