体细胞胚胎发生技术在植物快繁、种质资源保存、遗传转化、基因工程等领域具有广阔的应用前景和经济价值。迄今,椪柑体细胞胚胎发生的生理变化尚不清楚。本研究以椪柑胚性愈伤组织为起始材料进行体细胞胚的诱导,选取椪柑体细胞胚诱导过程中四个阶段的培养物:即刚接种的胚性愈伤组织(EI0)、转成黄色的胚性愈伤组织(EI1)、肉眼可见的胚状体(EI2)和出现50%以上的胚状体(EI3),进行可溶性蛋白含量、H 2O 2水平及抗氧化酶[过氧化物酶(Peroxidase, POD)、过氧化氢酶(Catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)]活力的测定。结果表明:可溶性蛋白含量先下降后逐渐升高;过氧化氢含量先逐渐上升后下降;从EI0到EI2过程三种酶活力都表现出先升高后下降的变化规律,但在EI2到EI3过程,POD、CAT活力下降,SOD活力则升高。 Somatic embryogenesis technique has already been widely applied in rapid clonal propagation of plant, preservation of germplasm resources, genetic transformation, genetic engineering, and other fields. The physiological of somatic embryogenesis in citrus is unclear to date. Embryonic calli of Ponkan were used for induction of somatic embryogenesis. The four materials during in-duction of somatic embryogenesis in the Ponkan were selected: inoculated embryonic calli (EI0), yellow embryonic calli (EI1), the embryos that can be seen with the naked eye (EI2) and more than 50% of the embryos (EI3). The content of soluble protein first declined and then increased gradually; the content of hydrogen peroxide gradually increased and then decreased; during EI0 to EI2, three types of enzyme activity increased and then decreased; but during EI2 to EI3, the activity of POD and CAT decreased, and the activity of SOD increased.
体细胞胚胎发生技术在植物快繁、种质资源保存、遗传转化、基因工程等领域具有广阔的应用前景和经济价值。迄今,椪柑体细胞胚胎发生的生理变化尚不清楚。本研究以椪柑胚性愈伤组织为起始材料进行体细胞胚的诱导,选取椪柑体细胞胚诱导过程中四个阶段的培养物:即刚接种的胚性愈伤组织(EI0)、转成黄色的胚性愈伤组织(EI1)、肉眼可见的胚状体(EI2)和出现50%以上的胚状体(EI3),进行可溶性蛋白含量、H2O2水平及抗氧化酶[过氧化物酶(Peroxidase, POD)、过氧化氢酶(Catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)]活力的测定。结果表明:可溶性蛋白含量先下降后逐渐升高;过氧化氢含量先逐渐上升后下降;从EI0到EI2过程三种酶活力都表现出先升高后下降的变化规律,但在EI2到EI3过程,POD、CAT活力下降,SOD活力则升高。
椪柑,体细胞胚胎发生,H2O2
Yuling Liu*, Xingchen Miao*, Mingzhou Gu, Xiaoyong Xu
School of Horticulture and Plant Protection, Yangzhou University, Yangzhou Jiangsu
Received: Apr. 6th, 2021; accepted: May 10th, 2021; published: May 18th, 2021
Somatic embryogenesis technique has already been widely applied in rapid clonal propagation of plant, preservation of germplasm resources, genetic transformation, genetic engineering, and other fields. The physiological of somatic embryogenesis in citrus is unclear to date. Embryonic calli of Ponkan were used for induction of somatic embryogenesis. The four materials during induction of somatic embryogenesis in the Ponkan were selected: inoculated embryonic calli (EI0), yellow embryonic calli (EI1), the embryos that can be seen with the naked eye (EI2) and more than 50% of the embryos (EI3). The content of soluble protein first declined and then increased gradually; the content of hydrogen peroxide gradually increased and then decreased; during EI0 to EI2, three types of enzyme activity increased and then decreased; but during EI2 to EI3, the activity of POD and CAT decreased, and the activity of SOD increased.
Keywords:Ponkan, Somatic Embryogenesis, H2O2
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体细胞胚胎发生(Somatic Embryogenesis),简称体胚发生,是指体细胞在特定条件下,未经性细胞融合而通过与合子胚类似发育途径形成新个体的形态发生过程。在离体培养条件下,体胚发生途径有两种,直接与间接发生途径 [
植物体胚发生过程实质上就是细胞分化过程,在分化的过程中必然发生有氧代谢,而活性氧是有氧代谢过程中的一种副产品。因此,体胚发生过程中也会发生活性氧变化及应激响应 [
虽然在不少植物上已开展体胚发生相关工作,但椪柑体细胞胚胎发生的生理变化尚不清楚。基于此,本论文以椪柑胚性愈伤组织为起始材料进行体细胞胚的诱导,分析该过程中其可溶性蛋白含量、三种抗氧化酶活力和活性氧水平的动态变化,以期了解抗氧化系统在柑橘体细胞胚胎发生中的作用。
供试材料取自华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室的椪柑(Citrus reticulata Blanco cv. Ponkan)胚性愈伤组织(郭文武教授惠赠)。胚性愈伤组织由珠心胚诱导产生,保存于MT基本培养基中,每20 d继代一次。
参照付春华 [
植物组织样本准备:于超净工作台内,称取样品,加入10 ml磷酸缓冲液,加适量石英砂于冰上研磨,将组织溶液于振荡机上充分混匀后,取2 ml溶液,12,000转/分,4℃下离心20 min,取上清液用于生理生化指标的测定。
可溶性蛋白含量、SOD、POD的测定参照李合生 [
过氧化氢含量、CAT活力均采用南京建成试剂盒测定。过氧化氢含量测定主要步骤为:准备空白管、标准管和测定管;在各管中分别加入试剂一,之后在各管中分别加入蒸馏水、163 mmol/L过氧化氢标准品应用液以及样本;混匀,37℃准确反应1分钟后,再分别加入试剂二;于405 nm处,1 cm光径,蒸馏水调零,测各管吸光度值。CAT活力测定原理:CAT分解过氧化氢的反应可通过加入钼酸铵而迅速中止,剩余的过氧化氢与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物,在405 nm处测定其生成量,可计算出结果CAT的活力,结果以U/mgprot表示。
每个试验进行了6次独立重复,测定的数据采用SPASS16.0软件进行统计分析,用EXCEL软件绘制图形。
将椪柑胚性愈伤组织(图1A)接种于含2 %甘油的MT培养基上培养,15天后胚性愈伤组织已大量增殖,且颜色都转为黄色(图1B);30天后胚性愈伤组织开始分化出肉眼可见的球形胚状体(图1C);45天后球形胚状体增加至50%以上(图1D)。根据椪柑体胚发育进程,我们选用上述四个阶段的培养物(EI0、EI1、EI2和EI3)进行后续的生理和分子试验。
如图2所示,在椪柑体细胞胚诱导过程中可溶性蛋白含量先下降后逐渐升高。其中EI3的可溶性蛋白含量最高,达55.43 mg/g;EI1的最低,为9.99 mg/g。四个时间点的培养物其可溶性蛋白含量存在显著差异。在EI1~EI3阶段,可溶性蛋白含量逐渐上升,且在EI3时达到最高,这说明胚状体形成初期需要大量的蛋白质。
图1. 椪柑体细胞胚的诱导。(A) 刚接种的胚性愈伤组织(EI0);(B) 转成黄色的胚性愈伤组织(EI1);(C) 肉眼可见的胚状体(EI2);(D) 出现50%以上的胚状体(EI3)
图2. 椪柑体细胞胚诱导过程中可溶性蛋白含量的变化。注:不同字母代表在0.05水平差异显著
如图3所示,在椪柑体细胞胚诱导过程中过氧化氢含量先逐渐上升后下降。其中EI2的过氧化氢含量最高,达12.28 mmol/gprot;EI0的最低,为3.05 mmol/gprot。这暗示着胚状体形成的早期阶段需要较高的活性氧含量。
图3. 椪柑体细胞胚诱导过程中过氧化氢含量的变化。注:不同字母代表在0.05水平差异显著
如图4所示,在椪柑体细胞胚诱导过程中,从EI0到EI2阶段三种酶活力都表现出先升高后下降的变化规律。其中,在椪柑愈伤组织转入含甘油的诱导培养基15天后,三种抗氧化酶活力都显著上升。这表明愈伤组织分化形成体胚的起始阶段可能存在氧化胁迫(EI1的活性氧含量是EI0的2.91倍),激活了体内抗氧化系统。而在EI2到EI3阶段,POD、CAT活力下降,SOD活力则升高。说明SOD活力上升可能对胚状体进一步发育有促进作用。
图4. 椪柑体细胞胚诱导过程中SOD、POD、CAT活力的变化。注:不同字母代表在0.05水平差异显著
蛋白质是生命活动的物质基础和重要调节物质,蛋白质数量和种类反映出植物代谢水平和发育阶段。因此,体胚发生过程中必然伴随着蛋白质含量的变化。已有研究表明,体胚发生与蛋白质含量的变化有密切关系,蛋白质在体胚发生的重要转折时期为其提供物质与能量 [
活性氧不仅在有氧代谢过程中产生,当植物受到各种胁迫时也会导致活性氧的增加。活性氧对于植物来说是一把双刃剑,因为植物的生长发育离不开活性氧,但是当植物体内活性氧超过细胞所能承受的值时则会造成细胞膜损伤甚至细胞死亡。已有研究表明,在植物体胚发生过程中,活性氧含量和抗氧化酶活力会发生显著变化 [
江苏省自然科学基金(BK20181454);扬州大学科技创新培育基金(2019CXJ120)。
刘玉玲,缪星辰,顾铭洲,徐小勇. 椪柑体细胞胚诱导过程中生理生化研究The Physiological and Biochemical Changes during Induction of Somatic Embryogenesis in Ponkan (Citrus reticulata Blanco)[J]. 植物学研究, 2021, 10(03): 239-245. https://doi.org/10.12677/BR.2021.103034