我国是食用植物油脂、油料进口大国,鉴于全球转基因油菜种植现状,由转基因油菜籽加工而成的菜籽油已经成为了消费者生活中的食用油,判定食用的菜籽油是否含有转基因成分,是国家监管部门和公众消费者密切关注的问题。食用植物油转基因成分检测技术长期以来受限于油脂中的核酸分离纯化,目前为止暂无现行有效的检测标准。本研究同时采用实时荧光PCR技术和微滴式数字PCR (ddPCR)技术检测初榨菜籽油中的外源基因成分,初探ddPCR技术用于检测食用植物油中转基因成分的可行性,结果显示,ddPCR检测结果与实时荧光PCR结果一致,均能检出转基因初榨菜籽油中的转基因成分,为后续开展食用植物油中转基因成分精准定量检测奠定了基础。 China is one of the biggest importers of edible vegetable oils and oilseeds. The oil made from trans-genic rapeseed has become cooking oil in consumers’ daily life if we look in view of the status of transgenic rape planting scale, thus, whether cooking oil contains transgenic ingredients concerns national regulators and the public. For a long time, detection of transgenic components in edible vegetable oil has been limited by the separation and purification of nucleic acids, and there is no effective detection standard currently. In present study, we detected exogenous transgenic components of rapeseed oil by using real-time fluorescent PCR and droplet digital PCR at the same time to see if ddPCR technology is suitable for detection of genetically modified ingredients in edible vegetable oil. The results showed that ddPCR test result is consistent with real-time fluorescence PCR, modified ingredients in virgin rapeseed oil are all detected genetically. This result laid a ground-work for accurate quantitative detection of transgenic components in edible oil in the near future.
我国是食用植物油脂、油料进口大国,鉴于全球转基因油菜种植现状,由转基因油菜籽加工而成的菜籽油已经成为了消费者生活中的食用油,判定食用的菜籽油是否含有转基因成分,是国家监管部门和公众消费者密切关注的问题。食用植物油转基因成分检测技术长期以来受限于油脂中的核酸分离纯化,目前为止暂无现行有效的检测标准。本研究同时采用实时荧光PCR技术和微滴式数字PCR (ddPCR)技术检测初榨菜籽油中的外源基因成分,初探ddPCR技术用于检测食用植物油中转基因成分的可行性,结果显示,ddPCR检测结果与实时荧光PCR结果一致,均能检出转基因初榨菜籽油中的转基因成分,为后续开展食用植物油中转基因成分精准定量检测奠定了基础。
初榨菜籽油,转基因,DNA,微滴式数字PCR
Yunfeng Long1, Yu Wang1, Li Ma1, Yiqian Wang1*, Erlong Liu2, Junyi Chen3, Yongsheng Lv1, Yun Liu1, Weijian Shen1, Jin Liu4, Dongwei Gao4, Maohua Wang5
1Animal, Plant and Food Inspection Center of Nanjing Customs, Nanjing Jiangsu
2Huanpu Customs, Guangzhou Guangdong
3Xuzhou Customs, Xuzhou Jiangsu
4Guangdong Key Laboratory of Import and Export Technical Measures of Animal, Plant and Food, Guangzhou Customs Technology Center, Guangzhou Guangdong
5Chian Certification & Accreditation Institute, Beijing
Received: Jun. 10th, 2021; accepted: Jul. 6th, 2021; published: Jul. 14th, 2021
China is one of the biggest importers of edible vegetable oils and oilseeds. The oil made from transgenic rapeseed has become cooking oil in consumers’ daily life if we look in view of the status of transgenic rape planting scale, thus, whether cooking oil contains transgenic ingredients concerns national regulators and the public. For a long time, detection of transgenic components in edible vegetable oil has been limited by the separation and purification of nucleic acids, and there is no effective detection standard currently. In present study, we detected exogenous transgenic components of rapeseed oil by using real-time fluorescent PCR and droplet digital PCR at the same time to see if ddPCR technology is suitable for detection of genetically modified ingredients in edible vegetable oil. The results showed that ddPCR test result is consistent with real-time fluorescence PCR, modified ingredients in virgin rapeseed oil are all detected genetically. This result laid a groundwork for accurate quantitative detection of transgenic components in edible oil in the near future.
Keywords:Virgin Rapeseed Oil, Transgene, DNA, Droplet Digital PCR
Copyright © 2021 by author(s) and Hans Publishers Inc.
This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0).
http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
食用植物油是极为重要的民生必需物资。菜籽油是我国第二大食用植物油,在我国食用植物油消费中占比超过25%。根据《农业转基因生物标识管理办法》,食用植物油脂中大豆油、菜籽油和玉米油属于农业转基因生物目录中规定实施标识管理的种类 [
微滴数字PCR (droplet digital PCR, ddPCR)是20世纪90年代末发展起来的一种核酸分子绝对定量技术 [
本研究选取花椰菜花叶病毒35S启动子基因(pCaMV35S)、农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子基因(tNOS)、玄参花叶病毒35S启动子基因(pFMV35S)以及豌豆二磷酸核酮糖羧化酶基因的终止子基因(tE9)为检测靶标,并以磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEP)作为油菜内参照基因,同时采用ddPCR方法和qPCR方法检测4份初榨菜籽油,初步探索ddPCR技术用于食用植物油中转基因成分检测的可行性。
本实验检测的4份初榨菜籽油样品由江苏某粮油公司提供,是采用压榨法获得的初榨菜籽油,样品编号分别为183、234、301、300;食用植物油DNA提取试剂盒购于宁波市重鼎生物技术有限公司;实时荧光PCR预混液购自上海辉睿生物科技有限公司,ddPCR Supermix for Probes、Droplet Generation Oil、Droplet Reader Oil购于美国Bio-Rad公司。
QX200TM Droplet DigitalTMPCR系统(Bio-Rad,美国,包括PCR扩增仪、微滴生成仪和微滴读取仪),ABI VIIA7荧光定量PCR仪(Applied Biosystem,美国),Nanodrop ND-1000核酸蛋白定量仪(Thermo Scientific,美国)。
本实验采用试剂盒法提取初榨菜籽油中的DNA,该试剂盒主要的原理是通过一种含有DNA亲和配体脂溶性载体,可以特异性结合食用植物油中的游离DNA,通过离心过柱,载体-DNA复合物吸附在离心柱内膜,再通过工具酶A切割释放DNA,最后使用微量离心柱对DNA进行浓缩纯化。
数字PCR和实时荧光PCR反应涉及的引物和探针序列参照SN/T 1204-2016《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,选择PEP基因作为菜籽油中转基因成分检测的内源参基因,具体序列见表1。
靶基因 Target | 引物名称 Primer name | 引物/探针序列(5’-3’) Primer/probe sequence | 扩增长度 Amplified length/bp |
---|---|---|---|
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 基因PEP | PEP F | cccttgtgaagctcgacatc | 110 |
PEP R | cttgtcctctctgaccattctttgt | ||
PEP P | FAM-ccgaccgtcacaccgatgttttaga-TAMRA | ||
花椰菜花叶病毒35S 启动子pCaMV35S | pCaMV35S F | gcctctgccgacagtggt | 100 |
pCaMV35S R | aagacgtggttggaacgtcttc | ||
pCaMV35S P | FAM-caaagatggacccccacccacg-TAMRA | ||
农杆菌的胭脂碱合成 酶基因终止子tNOS | tNOS F | catgtaatgcatgacgttatttatg | 165 |
tNOS R | ttgttttctatcgcgtattaaatgt | ||
tNOS P | FAM-atgggtttttatga-TAMRA | ||
玄参花叶病毒35S 启动子pFMV35S | pFMV35S F | cgaagacttaaagttagtgggcatct | 79 |
pFMV35S R | ttttgtctggtccccacaa | ||
pFMV35S P | FAM-atgggtttttatgattagagtcccgcaa-TAMRA | ||
豌豆二磷酸核酮糖羧化酶 基因的终止子tE9 | tE9 F | tgagaatgaacaaaaggaccatatca | 87 |
tE9 R | tttttattcggttttcgctatcg | ||
tE9 P | FAM-tcattaactcttctccatccatttccatttcacagt-TAMRA |
表1. 引物和探针序列
实时荧光PCR反应体系为:HR qPCR Master Mix 12.5 μL,上、下游引物各1 μL (浓度为10 μmoL/L),探针0.7 μL (浓度10 μmoL/L),DNA模板5 μL,加ddH2O至25 μL。PCR反应条件:95℃热激活及变性5 min,95℃变性18 s,60℃退火55 s,42个循环,退火时采集FAM荧光信号。
ddPCR反应体系为:上、下游引物各1.8 μL (浓度为10 μmoL/L),探针0.5 μL (浓度10 μmoL/L),ddPCR Super mix for Probes 10 μL,DNA模板5 μL,加ddH2O至20 μL。将配制好的20 μL反应液和70 μL微滴生成油分别加入微滴生成卡的对应位置,盖上一次性胶垫,放入微滴生成仪中生成微滴,将40 μL微滴全部转移至96孔板中,盖上专用铝膜后放进预热至180℃的PX1热封仪中封膜5 s,取出后利用普通PCR仪进行扩增。PCR反应参数:95℃热激活及变性10 min,95℃变性30s,60℃退火1 min,40个循环,98℃酶失活10 min,4℃保存,整个扩增过程升降温速度设置为2℃/S。PCR反应结束后,将96孔板平缓地放入微滴读取仪(QX200 droplet reader)中收集微滴信号,采用QuantaSoft Version 1.7.4.0917软件分析数据。每个样品ddPCR反应设置2个平行。
空白对照无扩增信号,各目标基因阳性对照均有扩增,说明ddPCR实验有效,可进行检测样品结果判定。ddPCR采用直接计数的方法进行拷贝数分析,认为有荧光信号反应单元中至少包含一个拷贝的目标分子,整体符合泊松分布。
本实验取样量为50 mL,提取过程按照试剂盒说明书进行。提取后采用超微量分光光度计测定DNA的浓度,提取的各油样DNA浓度见表2。实时荧光PCR扩增结果显示(图1):183、234、300、301四个待测样本的内参照PEP基因扩增Ct值依次为29.47、32.01、31.64、34.69,均小于35。ddPCR扩增结果显示(图2):183、234、300、301四个待测样本的内参照PEP基因拷贝数依次为:17.9、16.4、14.7、9.2 copies/μL,两个实验的结果均表明此次实验采用的DNA提取试剂盒从4份初榨的菜籽油中提取到了有效核酸,可继续进行外源基因的检测。
图1. 实时荧光PCR扩增油菜内参照PEP基因结果
图2. ddPCR扩增油菜内参照PEP基因结果
ddPCR对4个油样外源基因的检测结果见图3,从检测结果可以看出183和234号样品的pCaMV35S、tNOS、pFMV35S、tE9四种外源基因均检出,301号样品pCaMV35S、tNOS检出,pFMV35S、tE9未检出,300号样品四个外源基因均未检出。
图3. ddPCR方法检测结果
同时采用qPCR和ddPCR方法对四份初榨菜籽油进行转基因成分检测,检测结果见表2。qPCR检测结果中,184的pFMV35S、234的pFMV35S和tE9基因扩增Ct值介于36~40之间,不能立即判定结果,需进行复测。而ddPCR方法检测对应的3个基因的拷贝数分别为0.65、0.25和0.52 copies/μL,均可判为检出。其余的指标二种检测方法的检测结果一致。
样品编号 | DNA浓度 ng∙μL−1 | 目标基因 | qPCR | ddPCR | 结论 |
---|---|---|---|---|---|
CT值 | 拷贝数copies∙μL−1 | ||||
184 | 29.17 | pCaMV35S | 32.68 | 12.5 | 检出 |
tNOS | 31.37 | 10.3 | 检出 | ||
pFMV35S | 36.88 | 0.65 | 检出 | ||
tE9 | 32.26 | 15.7 | 检出 | ||
234 | 22.46 | pCaMV35S | 33.72 | 5.9 | 检出 |
tNOS | 33.53 | 8.7 | 检出 | ||
pFMV35S | 39.01 | 0.25 | 检出 | ||
tE9 | 37.12 | 0.52 | 检出 | ||
301 | 25.50 | pCaMV35S | 34.9 | 6.6 | 检出 |
tNOS | 30.53 | 14 | 检出 | ||
pFMV35S | 大于42 | No call | 检出 | ||
tE9 | 大于42 | No call | 未检出 | ||
300 | 18.63 | pCaMV35S | 大于42 | No call | 未检出 |
tNOS | 大于42 | No call | 未检出 | ||
pFMV35S | 大于42 | No call | 未检出 | ||
tE9 | 大于42 | No call | 未检出 |
表2. 初榨菜籽油中转基因成分分析表
利用PCR方法检测加工食品中的转基因成分,主要依赖于分离DNA质量、纯度和总量 [
目前已有70多个国家和地区出台了关于转基因产品标识管理的法规 [
国家重点研发计划项目(2018YFF0215605);南京海关科技计划项目(2021KJ18)。
龙云凤,王 宇,马 丽,王毅谦,刘二龙,陈君义,吕永生,刘 芸,沈伟健,刘 津,高东微,王茂华. 利用微滴式数字PCR技术检测初榨菜籽油中的转基因成分Detection of Genetically Modified Virgin Colza Oil by Droplet Digital PCR[J]. 农业科学, 2021, 11(07): 622-629. https://doi.org/10.12677/HJAS.2021.117086