多重耐药肺炎克雷伯菌导致的感染成为临床治疗的难点,本研究探索硫酸阿米卡星联合用药对多重耐药肺炎克雷伯菌的体外抑制作用,为临床用药提供数据参考。分别检测黄连提取物、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀及硫酸阿米卡星对多重耐药肺炎克雷伯菌的最小抑菌浓度,并以棋盘式微量稀释法分别检测三种药物与硫酸阿米卡星联合用药的抑菌效果。实验结果表明,联合用药后对全部耐药菌均表现为协同或相加作用,对治疗多重耐药肺炎克雷伯菌有较好的临床应用价值,值得进一步研究。 Infection caused by multiple drug resistance (MDR) Klebsiella pneumoniae has become a difficulty in clinical treatment. This study explored the inhibitory effect of amikacin sulfate combined with drugs on MDR K. pneumoniae in vitro, and provided data reference for clinical medication. The minimum inhibitory concentrations (MIC) of the extract of Coptis chinensis, berberine hydrochlo-ride, palmatine hydrochloride and amikacin sulfate on MDR K. pneumoniae were determined firstly, and then the antibacterial activities of amikacin sulfate combined with the other three medicines were observed by broth microdilution checkerboard method together with their Fractional Inhibitory Concentration (FIC). The inhibitory effects were showed synergistic or additive effects after combination on all of the ten MDR K. pneumoniae in vitro and had good clinical application value in the treatment of MDR K. pneumoniae, which was worthy of further study.
多重耐药肺炎克雷伯菌导致的感染成为临床治疗的难点,本研究探索硫酸阿米卡星联合用药对多重耐药肺炎克雷伯菌的体外抑制作用,为临床用药提供数据参考。分别检测黄连提取物、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀及硫酸阿米卡星对多重耐药肺炎克雷伯菌的最小抑菌浓度,并以棋盘式微量稀释法分别检测三种药物与硫酸阿米卡星联合用药的抑菌效果。实验结果表明,联合用药后对全部耐药菌均表现为协同或相加作用,对治疗多重耐药肺炎克雷伯菌有较好的临床应用价值,值得进一步研究。
硫酸阿米卡星,黄连提取物,盐酸小檗碱,盐酸巴马汀,肺炎克雷伯菌,多重耐药
Dengzhao Jiang1, Qingjing Wu1, Yufei Liu1, Lihua Shuai2*, Huai Liu2, Xiaohong Sun2, Ya Zhang2
1School of Pharmacy and Life Science, Jiujiang University, Jiujiang Jiangxi
2Department of Clinical Laboratory, Jiujiang University Hospital, Jiujiang Jiangxi
Received: Oct. 1st, 2021; accepted: Oct. 28th, 2021; published: Nov. 4th, 2021
Infection caused by multiple drug resistance (MDR) Klebsiella pneumoniae has become a difficulty in clinical treatment. This study explored the inhibitory effect of amikacin sulfate combined with drugs on MDR K. pneumoniae in vitro, and provided data reference for clinical medication. The minimum inhibitory concentrations (MIC) of the extract of Coptis chinensis, berberine hydrochloride, palmatine hydrochloride and amikacin sulfate on MDR K. pneumoniae were determined firstly, and then the antibacterial activities of amikacin sulfate combined with the other three medicines were observed by broth microdilution checkerboard method together with their Fractional Inhibitory Concentration (FIC). The inhibitory effects were showed synergistic or additive effects after combination on all of the ten MDR K. pneumoniae in vitro and had good clinical application value in the treatment of MDR K. pneumoniae, which was worthy of further study.
Keywords:Amikacin Sulfate, The Extract of Coptis chinensis, Berberine Hydrochloride, Palmatine Hydrochloride, Klebsiella pneumoniae, Multiple Drug Resistance
Copyright © 2021 by author(s) and Hans Publishers Inc.
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肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia, KP)是一种具有荚膜结构的侵袭力较强的革兰阴性杆菌,可引起呼吸道、血液、腹腔及泌尿系统等部位感染。2014~2019年中国耐药监测网(CHINET)统计结果显示肺炎克雷伯菌在所有致病菌的检出率仅次于大肠埃希菌,位居第二,对头孢曲松和头孢噻肟的耐药率分别为31.5%~34.6%、31.6%~39.9%;对环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率分别为17.3%~22.4%和13.6%~19.0%;对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为4.8%~10.5%和4.5%~10.9%,均出现了显著的上升 [
硫酸阿米卡星对照品(批号130335-200204)、盐酸小檗碱对照品(批号110713-201212)、盐酸巴马汀(批号110732-201510)均购自中国食品药品检定研究院。黄连药材购自九江开心人大药房,经九江学院刘可越教授鉴定为毛茛科植物黄连Coptischinnsis Franch.的干燥根茎。以95%乙醇,超声功率400 W提取3次,每次15 min,合并三次提取液浓缩至浸膏,冷冻干燥得到黄连提取物。
高频数控超声波提取仪KQ-500TDV (昆山市超声仪器有限公司),旋转蒸发仪(莱伯泰科EV341),真空冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司),实验室超纯水设备(重庆摩尔生物技术有限公司),立式压力蒸汽灭菌器(上海申安),Phoenix-100全自动微生物鉴定/药敏仪及配套鉴定药敏板条(美国BD公司)、BACTEC FX全自动血培养仪(美国BD公司)、Heal Force生物安全柜(B2级)、−80℃冰箱(海尔DW-86L386)、哥伦比亚血平板(OXOID)、中国兰琼脂及营养肉汤琼脂(杭州滨和)。
肺炎克雷伯菌多重耐药株分离自九江学院附属医院临床感染性标本,菌种的鉴定和常规药物敏感性实验由美国BD Phoenix-100全自动微生物鉴定/药敏仪及配套鉴定药敏板条完成。各项操作均严格按仪器标准操作规程进行。大肠埃希菌标准株(ATCC25922)及肺炎克雷伯菌标准株(ATCC700603)由中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)提供,所有实验菌种均于鉴定和药敏试验完成后保存于−80℃冰箱。除标准菌株ATCC25922外,选择2016~2019年间80株对头孢噻肟最小抑菌浓度MIC > 32 μg/mL的肺炎克雷伯菌,实验前将这些菌株从冰箱取出、复苏,转种于哥伦比亚血平板和中国兰平板,用于体外联合用药筛选研究。
ESBLs检测参照CLSI M100-S24文件推荐的纸片扩散确证法进行检测。用每片含30 μg头孢他啶、30 μg头孢噻肟和头孢他啶/克拉维酸(30 μg/10 μg)或头孢噻肟/克拉维酸(30 μg/10 μg)的复合纸片进行试验,当任何一种复合纸片抑菌圈直径大于或等于其单独药敏纸片抑菌圈直径5 mm时可确证该菌株产ESBLs。抗生素的敏感(S)、中介(I)、耐药(R)的判断折点及试验方法、质量控制遵循CLSI M100-S30文件:肺炎克雷伯菌对阿米卡星的MIC ≥ 64 μg/mL为耐药,MIC = 32 μg/mL为中介,MIC ≤ 16 μg/mL为敏感 [
以肺炎克雷伯菌标准株(ATCC700603)和大肠埃希菌标准株(ATCC25922)为质控菌株,采用微量肉汤稀释法分别测定硫酸阿米卡星、黄连提取物、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀各药物的MIC值,根据单药抑菌试验结果,按照棋盘稀释法进行联合抑菌作用观察,计算部分抑菌浓度(FIC)指数。FIC = MIC甲药联用/MIC甲药单用 + MIC乙药联用/MIC乙药单用,FIC ≤ 0.5为协同作用,0.5 < FIC ≤ 1为相加作用,1 < FIC ≤ 2为无关作用,FIC > 2为拮抗作用 [
从82株对头孢噻肟的MIC > 32 μg/mL的肺炎克雷伯菌中,共筛选出10株对头孢噻肟MIC ≥ 256 μg/mL,头孢他啶MIC > 32 μg/mL,头孢吡肟MIC > 16 μg/mL,氨曲南MIC > 16 μg/mL,同时对阿米卡星呈耐药(5株)、中介(3株)、敏感(2株)的多重耐药肺炎克雷伯菌(编号:164153、164368、166276、171245、175173、177986、186472、187765、191343、193215),其中177986号对亚胺培南和美罗培南MIC > 8 μg/mL,显示对碳青酶烯类抗生素耐药。
上述筛选出的10株肺炎克雷伯菌,经纸片扩散确证法检测均为产ESBLs多重耐药菌株。
实验结果表明,黄连提取物、盐酸小檗碱和盐酸巴马汀与阿米卡星联用后,所筛选的10株多重耐药菌对阿米卡星的MIC值出现明显下降,降低了2~4个浓度梯度;而黄连提取物、盐酸小檗碱和盐酸巴马汀的MIC都降低了2~8个浓度梯度,表现出明显的协同或相加作用(见表1,表2,表3),显示出非常好的联合用药效果;尤其是盐酸巴马汀与阿米卡星联用后对所测定耐药菌均产生协同作用,且所有菌株对阿米卡星的MIC值降至16 μg/ml及以下,成为敏感菌株(MIC ≤ 16),显示出非常良好的体外抗菌效果。
菌株 | 黄连提取物(μg/ml) | 阿米卡星(μg/ml) | FIC | 作用方式 | ||
---|---|---|---|---|---|---|
单用 | 联用 | 单用 | 联用 | |||
ATCC25922 | 78 | 4.9 | 4 | 1 | 0.313 | 协同 |
ATCC700603 | 78 | 4.9 | 4 | 1 | 0.313 | 协同 |
164153 | 2500 | 39 | 8 | 2 | 0.266 | 协同 |
164368 | 2500 | 78 | 16 | 1 | 0.094 | 协同 |
166276 | 1250 | 39 | 32 | 4 | 0.156 | 协同 |
175173 | 2500 | 39 | 32 | 16 | 0.516 | 相加 |
171245 | 2500 | 9.8 | 32 | 4 | 0.129 | 协同 |
177986 | 2500 | 625 | 64 | 32 | 0.750 | 相加 |
186472 | 2500 | 39 | 64 | 16 | 0.266 | 协同 |
187765 | 2500 | 78 | 128 | 32 | 0.281 | 协同 |
191343 | 1250 | 78 | 128 | 32 | 0.312 | 协同 |
193215 | 2500 | 625 | 128 | 64 | 0.750 | 相加 |
表1. 黄连提取物与阿米卡星联用对产ESBLs酶肺炎克雷伯菌的体外抗菌作用
菌株 | 盐酸小檗碱(μg/ml) | 阿米卡星(μg/ml) | FIC | 作用方式 | ||
---|---|---|---|---|---|---|
单用 | 联用 | 单用 | 联用 | |||
ATCC25922 | 8 | 1 | 4 | 1 | 0.375 | 协同 |
ATCC700603 | 8 | 1 | 4 | 1 | 0.375 | 协同 |
164153 | 512 | 32 | 8 | 2 | 0.313 | 协同 |
164368 | 1024 | 64 | 16 | 2 | 0.188 | 协同 |
166276 | 512 | 32 | 32 | 4 | 0.188 | 协同 |
175173 | 512 | 32 | 32 | 8 | 0.312 | 协同 |
171245 | 1024 | 32 | 32 | 4 | 0.156 | 协同 |
177986 | 1024 | 256 | 64 | 32 | 0.750 | 相加 |
186472 | 1024 | 64 | 64 | 4 | 0.125 | 协同 |
187765 | 1024 | 32 | 128 | 16 | 0.156 | 协同 |
191343 | 1024 | 64 | 128 | 32 | 0.313 | 协同 |
193215 | 1024 | 64 | 128 | 64 | 0.563 | 相加 |
表2. 盐酸小檗碱与阿米卡星联用对产ESBLs酶肺炎克雷伯菌的体外抗菌作用
菌株 | 盐酸巴马汀(μg/ml) | 阿米卡星(μg/ml) | FIC | 作用方式 | ||
---|---|---|---|---|---|---|
单用 | 联用 | 单用 | 联用 | |||
ATCC25922 | 128 | 2 | 4 | 1 | 0.266 | 协同 |
ATCC700603 | 128 | 2 | 4 | 1 | 0.266 | 协同 |
164153 | 512 | 8 | 8 | 2 | 0.266 | 协同 |
164368 | 512 | 32 | 16 | 4 | 0.313 | 协同 |
166276 | 512 | 8 | 32 | 8 | 0.266 | 协同 |
175173 | 512 | 8 | 32 | 2 | 0.078 | 协同 |
171245 | 512 | 8 | 32 | 4 | 0.141 | 协同 |
177986 | 512 | 16 | 64 | 8 | 0.156 | 协同 |
186472 | 1024 | 32 | 64 | 8 | 0.156 | 协同 |
187765 | 1024 | 64 | 128 | 16 | 0.188 | 协同 |
191343 | 1024 | 32 | 128 | 16 | 0.156 | 协同 |
193215 | 1024 | 64 | 128 | 16 | 0.188 | 协同 |
表3. 盐酸巴马汀与阿米卡星联用对产ESBLs酶肺炎克雷伯菌的体外抗菌作用
临床抗生素的大量应用使细菌的抗药性问题日益严重,耐药菌感染频发,产ESBLs肺炎克雷伯菌的检出率及耐药率均逐年升高 [
氨基糖苷类抗生素对肺炎克雷伯菌的临床治疗效果较好,但随着产ESBLs肺炎克雷伯菌的增加,其耐药性逐步升高,治疗效果也在逐渐降低 [
令人惊喜的是,本研究中177986号为耐碳青酶烯类肺炎克雷伯菌(CRKP),盐酸巴马汀与阿米卡星联合用药后显示了出人意料的效果,不仅产生了协同作用,并且将其由耐药菌转变为敏感菌,这种联合用药是否对其他CRKP同样具有逆转作用,需要进一步的实验数据支持。
江西省自然科学基金项目(编号:20192BAB205106),江西省2020年大学生创新创业训练计划项目(编号:S202011843028)。
姜登钊,吴青静,刘雨霏,帅丽华,刘 怀,孙晓红,张 娅. 硫酸阿米卡星与黄连成分联合用药对多重耐药肺炎克雷伯菌的体外活性研究Research on Antibacterial Activities of Amikacin Sulfate Combined with the Ingredients of Coptis chinensis against Multiple Drug Resistance Klebsiella pneumoniae in vitro[J]. 药物资讯, 2021, 10(06): 315-320. https://doi.org/10.12677/PI.2021.106039