消化性溃疡(peptic ulcer disease)包含胃溃疡与十二指肠溃疡,其中胃溃疡泛指胃黏膜发生溃疡病灶。造成胃溃疡的主要因素有幽门螺旋菌与非类固醇消炎止痛药(nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)等。益生菌长年被研究具肠胃道保健的效果,故本研究以复合益生菌作为初次筛选具减缓NSAIDs造成胃溃疡的益生菌。试验采用8周龄ICR品系之雄性小鼠,分为正常组、负对照组、正对照组(10 mg/kg Omeprazole)、以及8组的复合益生菌组(20.4 mg/kg/day)。除正常组外,其余小鼠于喂食试验物29天后,再连续10天,每天管喂500 mg/bw Aspirin诱发胃溃疡,并于第40天牺牲进行胃部溃疡程度分析。结果在胃部溃疡面积、溃疡指数、溃疡治愈率及病理总和评分分析中,以复合菌 Lactobacillus plantarum GKD7和 Pediococcus acidilactici GKA4的组合最具显著改善现象。故未来可针对复合菌株GKD7/GKA4做单只菌株于胃部保健的深入机制研究。 Peptic ulcer disease includes gastric ulcer (GU) and duodenal ulcer. GU generally refers to ulcer lesions in the gastric mucosa. The main factors that cause GU are Helicobacter pylori and nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs). Probiotics have been studied for many years with the effects on gastrointestinal health. Therefore, we first screened complex probiotics for the effects on reducing the NSAIDs-induced GU. 8-week-old ICR male mice were divided into a normal control group, a negative control group, a positive control group (10 mg/kg Omeprazole), and 8 groups of complex lactic acid bacteria (20.4 mg/kg/day). Except for the normal control group, mice were fed with probiotics or saline for 29 days, then 10 consecutive days with addition of 500 mg/bw/day Aspirin to induce GU. On the 40th day, mice were sacrificed for GU analysis. In the analysis of GU area, ulcer index, ulcer curative ratio, and pathological score, the combination of Lactobacillus plantarum GKD7 and Pediococcusacidilactici GKA4 was the most significant improvement. Therefore, complex strains GKD7/GKA4 would be further separated as a single strain for the mechanism studying on gastric protection.
消化性溃疡(peptic ulcer disease)包含胃溃疡与十二指肠溃疡,其中胃溃疡泛指胃黏膜发生溃疡病灶。造成胃溃疡的主要因素有幽门螺旋菌与非类固醇消炎止痛药(nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)等。益生菌长年被研究具肠胃道保健的效果,故本研究以复合益生菌作为初次筛选具减缓NSAIDs造成胃溃疡的益生菌。试验采用8周龄ICR品系之雄性小鼠,分为正常组、负对照组、正对照组(10 mg/kg Omeprazole)、以及8组的复合益生菌组(20.4 mg/kg/day)。除正常组外,其余小鼠于喂食试验物29天后,再连续10天,每天管喂500 mg/bw Aspirin诱发胃溃疡,并于第40天牺牲进行胃部溃疡程度分析。结果在胃部溃疡面积、溃疡指数、溃疡治愈率及病理总和评分分析中,以复合菌Lactobacillus plantarum GKD7和Pediococcus acidilactici GKA4的组合最具显著改善现象。故未来可针对复合菌株GKD7/GKA4做单只菌株于胃部保健的深入机制研究。
消化性溃疡,非类固醇消炎止痛药,益生菌,胃部保护
Shih-Yang Tzu1, You-Shan Tsai1, Shih-Wei Lin1, Wen-Shin Wu2, Yen-Lien Chen1, Chin-Chu Chen3*
1Bioengineering Center, Grape King Bio Ltd., Taoyuan Taiwan
2Shanghai Grape King Enterprise Co., Ltd., Shanghai
3Institute of Food Science and Technology, National Taiwan University, Taipei Taiwan
Received: Nov. 18th, 2021; accepted: Jan. 12th, 2022; published: Jan. 21st, 2022
Peptic ulcer disease includes gastric ulcer (GU) and duodenal ulcer. GU generally refers to ulcer lesions in the gastric mucosa. The main factors that cause GU are Helicobacter pylori and nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs). Probiotics have been studied for many years with the effects on gastrointestinal health. Therefore, we first screened complex probiotics for the effects on reducing the NSAIDs-induced GU. 8-week-old ICR male mice were divided into a normal control group, a negative control group, a positive control group (10 mg/kg Omeprazole), and 8 groups of complex lactic acid bacteria (20.4 mg/kg/day). Except for the normal control group, mice were fed with probiotics or saline for 29 days, then 10 consecutive days with addition of 500 mg/bw/day Aspirin to induce GU. On the 40th day, mice were sacrificed for GU analysis. In the analysis of GU area, ulcer index, ulcer curative ratio, and pathological score, the combination of Lactobacillus plantarum GKD7 and Pediococcusacidilactici GKA4 was the most significant improvement. Therefore, complex strains GKD7/GKA4 would be further separated as a single strain for the mechanism studying on gastric protection.
Keywords:Peptic Ulcer Disease (PUD), Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs (NSAIDs), Probiotics, Gastric Protection
Copyright © 2022 by author(s) and Hans Publishers Inc.
This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0).
http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
消化性溃疡疾病(peptic ulcer disease, PUD)是胃部或十二指肠局部黏膜损伤深度超过黏膜基层(muscularis mucosae),导致胃酸持续分泌与刺激,使黏膜损伤后出现症状如上腹部疼痛、心口烧灼、胃酸逆流等的病态 [
阿司匹林为常见的NSAIDs之一,具有抗血小板凝集的作用,广泛用于心脑血管疾病的预防,长期使用阿司匹林的患者中,消化性溃疡、消化性出血等胃肠道不良反应发生率明显升高,已引起了临床医师的关注 [
益生菌(probiotics)泛指对人体有益的菌,常见为乳酸菌(Lactobacillus spp.)或比菲德氏菌(Bifidobacterium spp.),亦有些像是片球菌(Pediococcus spp.)、芽孢杆菌(Bacillus spp.),以及链球菌 (Streptococcus spp.)等。因能长存于人体肠道中,多半具有耐酸、耐胆盐的特性。益生菌亦多被研究具有肠胃道保护的作用,如减缓肠道发炎、抗菌,或调节肠道菌相影响宿主生理状态等 [
菌株分离来源与16S rRNA鉴定结果如表1,所有试验菌株皆有取得寄存编号于台湾生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center, BCRC, Taiwan)。
将各菌株培养于1 L 之MRS培养基(Difco, BD, USA)中,经16小时37℃培养后,以25℃转速5000 rpm (Centrifuge 5804 R, Eppendorf, Germary),离心10分钟取得菌泥,再混入20%脱脂奶粉后冷冻干燥取得活菌菌粉,保存于−20℃备用。各试验复合菌株样品,以各菌粉1:1随机两两组合(表1)。
复合菌株组别mixture | 菌株Strain | 寄存编号No. | 分离来源Source |
---|---|---|---|
GKJOY/GKB2组 | 短乳杆菌GKJOY (Lactobacillus brevis GKJOY) | BCRC 910920 | 酸泡菜 |
两歧双歧杆菌GKB2 (Bifidobacterium bifidum GKB2) | BCRC 910986 | 婴儿粪便 | |
GKLR/GKC1组 | 鼠李糖乳杆菌GKLR (Lactobacillus rhamnosus GKLR) | BCRC 910828 | 台湾妇女母奶 |
干酪乳杆菌GKC1 (Lactobacillus casei GKC1) | BCRC 910825 | 台湾妇女母奶 | |
GKL7/GKA7组 | 长双歧杆菌GKL7 (Bifidobacterium longum GKL7) | BCRC 910988 | 成人粪便 |
嗜酸乳杆菌GKA7 (Lactobacillus acidophilus GKA7) | BCRC 910985 | 婴儿粪便 | |
GKJ2/GKY7组 | 约氏乳杆菌GKJ2 (Lactobacillus johnsonii GKJ2) | BCRC 910999 | 台湾妇女母奶 |
鼠李糖乳杆菌GKY7 (Lactobacillus plantarum GKY7) | BCRC 910918 | 婴儿粪便 | |
GKD7/GKA4组 | 植物乳杆菌GKD7 (Lactobacillus plantarum GKD7) | BCRC 910877 | 台式泡菜 |
乳酸片球菌GKA4 (Pediococcus acidilactici GKA4) | BCRC 910876 | 酸辣椒 | |
GKM3/GKK1组 | 植物乳杆菌GKM3 (Lactobacillus plantarum GKM3) | BCRC 910787 | 芥菜 |
植物乳杆菌GKK1 (Lactobacillus plantarum GKK1) | BCRC 910919 | 酸辣椒 | |
GKF3/GKR1组 | 发酵乳杆菌GKF3 (Lactobacillus fermentum GKF3) | BCRC 910824 | 台式泡菜 |
罗伊氏乳杆菌GKR1 (Lactobacillus reuteriGKR1) | BCRC 910827 | 婴儿粪便 | |
GKK2/GKP4组 | 乳双歧杆菌GKK2 (Lactobacillus lactis GKK2) | BCRC 910826 | 婴儿粪便 |
戊醣片球菌GKP4 (Pediococcus pentosaceus GKP4) | BCRC 910879 | 酸辣椒 |
表1. 益生菌来源与复合组合
8周龄ICR雄性小鼠购自台湾乐斯科生物科技公司(BioLASCO Taiwan Co. Ltd., Taiwan),每只体重约25公克。动物饲养在GLP动物试验室,动物房温度控制23℃ ± 2℃,湿度控制55% ± 5%,光照与黑暗各12小时,饲料及逆渗透水均任由小鼠自由取食。本试验之试验小鼠经台湾农业科技研究院(Agriculture Technology Research Institute, ATRI)之实验动物照护及使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)审查同意,取得IACUC号码109048。
小鼠经一周适应期后,随机分为11组,每组6只。分别为正常控制组(normal control, N)、负对照组(negative control, NC)、正对照组(positive control, PC)、以及8组复合益生菌组。复合益生菌组以20.4 mg/kg b.w./day连续39天管喂各益生菌,PC组每日以20 mg/kg管喂奥美拉唑(Omeprazole),N组与NC组每日则以饮用水取代之。除N组外,各组于第29天管喂500 mg/kg b.w./day Aspirin连续10天诱发胃溃疡,于第40天以肌肉注射50 mg/mL的舒泰50 (Zoletil 50, Cat. No. 5TK3, Virbac Laboratories, France)牺牲老鼠后,进行各项胃溃疡程度与病理分析。
取出并剪开小鼠胃部黏膜面拍照记录。利用ImageJ软件将胃部组织的溃疡灶圈出,计算小鼠胃部位溃疡灶面积。胃溃疡面积小于1 mm2给予分数1 (level 1),胃溃疡面积介于1~3 mm2给予分数2 (level 2),胃溃疡面积大于3 mm2给予分数3 (level 3)。胃溃疡程度以胃溃疡指数(Ulcer index, UI) (1)与治愈率(Curative ratio, %) (2)呈现。
溃 疡 指 数 : Ulcerindex ( UI ) = ( 1 × levelI 数 量 ) + ( 2 × levelII 数 量 ) + ( 3 × levelIII 数 量 ) 各 组 试 验 小 鼠 数 量 (1)
治 愈 率 Curativeratio ( % ) = UI 测 试 样 品 组 × 1 00 UI 对 照 组 (2)
利用中性10%福尔马林液固定小鼠胃部组织,将胃腺体部以横切方式修片并放入包埋盒内,经脱水、石蜡浸润及包埋等步骤制成石蜡组织块,以石蜡组织切片机(Leica RM 2145, Nussloch Germany)切成4 m 厚度组织切片,再以Hematoxylin & Eosin (H&E)染色,于光学显微镜下观察各组的胃组织学变化。
以黏膜溃疡、炎症细胞浸润与黏膜上皮再生3项评估指标进行病理分析。病变严重度的判定是参照 Shackelford等人(2002)、Chiu等人(2014)、Hardbower等人(2017),以及Park等人(2018)所发表之文献判定标准为依据 [
表示Aspirin造成胃黏膜上皮细胞发生坏死而导致溃疡病灶的严重度。等级0为正常组织无发生溃疡;等级1为胃黏膜发生表浅层溃疡病灶约为1/3以内;等级2为胃黏膜发生表浅层至中层溃疡约为1/2;等级3为胃黏膜发生表浅层至深层溃疡约为2/3;等级4代表胃黏膜上皮全层溃疡且病灶穿透肌肉层达到3/3。
表示Aspirin造成炎症细胞浸润于胃组织病灶区的严重度。等级0代表无炎症细胞浸润;等级1为局部极轻微炎症细胞浸润;等级2为多发局部轻微炎症细胞浸润;等级3为部分区域具连续性中等程度炎症细胞浸润;等级4代表严重炎症细胞浸润。
表示Aspirin造成黏膜上皮伤害后之再生现象程度。等级0为无出现黏膜上皮再生;等级1属于极轻微程度;等级2为轻微程度;等级3为中等程度;等级4为严重程度。
实验结果以平均值(mean) ± 平均标准偏差误差(standard error of the mean, SEM)表示,使用Graphpad Prism 6统计分析软件,进行one-way/two-way analysis of variance统计分析。以*p < 0.05表示具显著差异。
图1为试验期间,每周小鼠的体重变化,结果显示各组间体重变化无显著差异(p > 0.05)。此亦说明测试之复合菌株不影响小鼠的体重变化,以及不会造成小鼠不适。
图1. 试验期间小鼠体重变化
图2(a)为各组小鼠胃部溃疡的面积。结果显示,NC组的溃疡面积为26.01 ± 2.98 mm2显著高于N组,且施予治疗胃溃疡的市售药物奥美拉唑(PC组)后,溃疡面积降为7.12 ± 2.15 mm2,说明此胃溃疡动物模式相当具参考性,可接续讨论本次筛选的复合菌株对于胃保护的效果。
图2. 小鼠胃部溃疡面积(a)与溃疡指数(b)。数据以mean ± SEM呈现,与Aspirin组(NC)比较具显著差异者表示*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001
胃溃疡面积结果显示,8个复合益生菌组别在此次的Aspirin诱导胃损伤下皆具有减缓胃部溃疡面积的效果。小鼠经Aspirin造成胃损伤面积较少者为复合菌GKLR/GKC1组、GKL7/GKA7组、GKJ2/GKY7组和GKD7/GKA4组(图2(a))。然而,以溃疡面积加乘计算胃溃疡指数(UI)后,以复合菌GKJ2/GKY7组和GKD7/GKA4组的胃溃疡指数最低,其次为GKM3/GKK1组(图2(b))。将PC组的胃溃疡指数分别与效果最好的两组复合菌组(GKJ2/GKY7、GKD7/GKA4)比较后并没有发现显著差异(p > 0.05)。
以治愈率来看,复合菌GKD7/GKA4组的治愈率最佳,可达60%以上的治愈率,甚至优于PC组的53%,其次依序为GKM3/GKK1、GKJOY/GKB2、以及GKJ2/GKY7,皆有接近40%的治愈率(图3)。
图3. 小鼠胃部溃疡治愈率
小鼠胃部的病理切片如图4所示,可见N组无任何黏膜溃疡、炎症、或黏膜再生的情况;然而,NC组有的老鼠胃部呈现严重的黏膜溃疡、发炎浸润,以及严重的细胞病变坏死等情况。PC组则虽有部分溃疡等情况,但普遍比NC组的溃疡程度还来得低。而复合菌组别皆观察到较少的发炎或溃疡现象。
将黏膜溃疡、发炎细胞浸润及黏膜上皮再生之病理评分加总后呈现于图5。与Asprin组(NC)相比,测试的复合菌株中,以GKLR/GKC1最为显著减少胃部组织病变上的分数(p < 0.05) (图5)。虽然GKD7/GKA4组没有与NC组产生统计上的显著差异,但仍然也有降低病变评分的趋势。
消化系统溃疡的成因主要是黏膜的保护因子与攻击(破坏)因子失去平衡所造成的。黏膜的保护因子包含黏液、重碳酸盐分泌、细胞再生、血管新生、黏膜血流、前列腺素合成等;而黏膜的攻击因子则包含胃酸、胃蛋白、胆酸、缺氧、压力、幽门杆菌、消炎止痛药、烟酒、咖啡等刺激物。其中,NSAIDs药物的作用在于减少胃黏膜之厌水性(hydrophobicity),使胃酸与胃蛋白酶可轻易穿透胃黏膜造成伤害 [
肠胃道透过黏膜屏障包含物理屏障、化学屏障和生物屏障等,来达到保护的作用。高等人(2012)研究指出,益生菌在保护阿司匹林致大鼠胃黏膜损伤的作用机制其一为通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)中的p38信号通路上调胃黏膜上皮黏膜紧密连接蛋白Occludin的表达,进而增强了大鼠胃黏膜的物理屏障功能 [
图4. 小鼠胃组织H&E染色
图5. 小鼠胃部病理评分。数据以mean ± SEM呈现,与Aspirin组(NC)比较具显著差异者表示*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001
在本次的筛选中,可见不同菌株在影响胃保护作用上的差异性,像是减少溃伤面积(图2)、病变程度(图4)。后续会针对菌株Lactobacillus plantarum GKD7和Pediococcusacidilactici GKA4再做一次胃保护的试验,分别出最有胃保护效果的菌株,以及其相关的机制探讨。
本试验利用复合菌株提高筛选基数,作为初步筛选具胃部保护潜力的益生菌。实验分别以胃部溃疡程度及病理切片讨论复合菌摄入4周后于Asprin诱导下的小鼠之胃部保护效果。结果复合菌GKJ2/GKY7和GKD7/GKA4显著减缓胃溃疡指数;以治愈率而言,又以GKD7/GKA4组改善效果最佳。病理评分上,则以复合菌GKLR/GKC1改善最为显著,其次为复合菌GKD7/GKA4。综观上述实验结果,本筛选以复合菌GKD7/GKA4组为佳。后续将分别以Lactobacillus plantarum GKD7和Pediococcus acidilactici GKA4进行关于胃部保护的深入研究。
石仰慈,蔡侑珊,林诗伟,吴文歆,陈炎炼,陈劲初. 复合益生菌减缓阿司匹林诱导小鼠胃部损伤之筛选 A Screening of Complex Probiotics for Reducing Aspirin-Induced Gastric Injury in Mice[J]. 食品与营养科学, 2022, 11(01): 27-35. https://doi.org/10.12677/HJFNS.2022.111004