研究目的:研制转基因苜蓿J163品系的基体定性标准样品,从而提高转基因苜蓿J163品系检测的科学性和一致性。方法:将经PCR方法验证的转基因J163品系苜蓿种子作为候选物,通过研磨、过筛、搅拌、冷冻抽干制备得到定性标准样品,分装后进行均匀性和稳定性检验,并联合8家外部实验室对标准样品进行了定值。结果:经8家权威实验室协同定值验证,PCR检测的结果判定均为转基因苜蓿J163品系阳性,与研制单位的检测结果相一致。结论:制备的标准样品均匀性和稳定性均达到了国家标准样品的技术要求,可用于转基因苜蓿J163品系分子检测技术的质量控制、检测试剂的验证和评价。 Aim: The matrix qualitative reference material of genetically modified alfalfa event J163 was de-veloped to improve the scientificity and consistency of J163 detection. Method: The J163 alfalfa seeds verified by PCR method were used as candidates, and the qualitative reference material was prepared by grinding, screening, stirring and freeze-drying. After sub packaging, the uniformity and stability were tested, and the reference material was evaluated in conjunction with 8 external laboratories. Results: The results of PCR verified by 8 authoritative laboratories were all positive for genetically modified alfalfa event J163, which was consistent with the test results of the development laboratory. Conclusion: The uniformity and stability of the prepared reference material meet the technical requirements of the national reference material, and can be used for the quality control of molecular detection technology of genetically modified alfalfa event J163 and the verification and evaluation of detection reagents.
研究目的:研制转基因苜蓿J163品系的基体定性标准样品,从而提高转基因苜蓿J163品系检测的科学性和一致性。方法:将经PCR方法验证的转基因J163品系苜蓿种子作为候选物,通过研磨、过筛、搅拌、冷冻抽干制备得到定性标准样品,分装后进行均匀性和稳定性检验,并联合8家外部实验室对标准样品进行了定值。结果:经8家权威实验室协同定值验证,PCR检测的结果判定均为转基因苜蓿J163品系阳性,与研制单位的检测结果相一致。结论:制备的标准样品均匀性和稳定性均达到了国家标准样品的技术要求,可用于转基因苜蓿J163品系分子检测技术的质量控制、检测试剂的验证和评价。
转基因苜蓿J163品系,定性标准样品
Xinmiao Liang1*, Zhenglei Guo1, Yuhan Zhang2, Ruifeng Zhang3, Ruosi Liu1#
1Science and Technology Research Center of China Customs, Beijing
2Animal, Plant and Foodstuffs Inspection Centre of Tianjin Customs, Tianjin
3Zhongrong (Tianjin) Science and Technology Development Co., Ltd., Tianjin
Received: Jan. 28th, 2022; accepted: Mar. 9th, 2022; published: Mar. 16th, 2022
Aim: The matrix qualitative reference material of genetically modified alfalfa event J163 was developed to improve the scientificity and consistency of J163 detection. Method: The J163 alfalfa seeds verified by PCR method were used as candidates, and the qualitative reference material was prepared by grinding, screening, stirring and freeze-drying. After sub packaging, the uniformity and stability were tested, and the reference material was evaluated in conjunction with 8 external laboratories. Results: The results of PCR verified by 8 authoritative laboratories were all positive for genetically modified alfalfa event J163, which was consistent with the test results of the development laboratory. Conclusion: The uniformity and stability of the prepared reference material meet the technical requirements of the national reference material, and can be used for the quality control of molecular detection technology of genetically modified alfalfa event J163 and the verification and evaluation of detection reagents.
Keywords:Genetically Modified Alfalfa Event J163, Qualitative Reference Material
Copyright © 2022 by author(s) and Hans Publishers Inc.
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苜蓿是草食动物的优质饲草,被誉为“牧草之王”。近年来,全球转基因苜蓿种植面积呈逐年上升的趋势(ISAAA, 2020),2019年达到1.30 × 106 hm2,主要种植国为美国,产量居全球首位 [
抗草甘膦转基因苜蓿品系J163(商品名 Roundup Ready Alfalfa Events J163)是由美国孟山都公司研制开发的一种转基因苜蓿草品系,具有抗倒伏和控制杂草的特点 [
以本实验室保存的转基因苜蓿J163种子作为研制J163品系标准样品的候选物。
中国检疫科学研究院植物检验与检疫研究所种子样品直接扩增试剂盒、天根新型植物基因组DNA提取试剂盒、天根PCR MIX、DNA Maker DL2000、ABI TaqMan Universal PCR Master Mix,引物和探针由上海Sangon公司合成,稀释为终浓度为10 µmol/L的工作浓度使用。
提取本实验室保存的转基因苜蓿J163种子的基因组总DNA,按照《农业部2122号公告-6-2014转基因植物及其产品成分检测耐除草剂苜蓿J163及其衍生品种定性PCR方法》中规定的检测方法进行鉴定。
为确定该候选物中不含有其它已知的转基因成分,本研究依据检验检疫行业标准SN/T 1204-2016《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》 [
转基因苜蓿J163种子装于透气种子袋中,放置于真空冷冻干燥仪中,干燥24 h。干燥后的转基因苜蓿J163种子装于研磨罐中,液氮预冷,利用冷冻研磨仪进行研磨,研磨程序为30 frequcy/s,运行1分钟,停止2 min,5个循环。研磨后迅速转移至冷冻干燥仪中干燥24 h。使用180目标准筛进行分筛。
分别称取20 mg、50 mg、100 mg标准样品粉末,提取基因组总DNA,并将总DNA稀释10倍,以提取好的总DNA及稀释10倍的总DNA为模板按照2.2.1规定的普通PCR方法进行扩增。
按照GB/T 15000.3-2008《标准样品工作导则(3) 标准样品定值的一般原则和统计方法》 [
1) 长期贮存稳定性
将制备好的样品置于−20℃、4℃,按先密后疏的原则在不同时间(0天、1个月、3个月、6个月、12个月、18个月、24个月)抽取样品,每次随机抽取3管样品,提取样品总DNA,采用1.2.1规定的普通PCR方法进行检测,每管检测2次,监测样品在储存温度下随时间的变化情况。
2) 短期运输稳定性
考虑到样品的寄送温度和时间,分别将样品置于37℃、室温(20℃~25℃)、4℃和−20℃,分别放置0周、2周、4周、8周,从制备好的样品中,每次随机抽取3管样品,提取样品总DNA,采用2.2.1中规定的普通PCR方法进行检测,每管检测2次,监测样品在储存温度下随时间的变化情况。
本标准样品的定值采用2.2.1中规定的普通PCR方法,与多个实验室合作定值的方式进行。测量时,要求操作者独立地进行操作,并尽可能使用不同的实验仪器。选取8家具有该标准样品定值检测必备条件,且有一定技术权威性的实验室进行合作定值。
鉴定结果表明,苜蓿内标准基因ACC的PCR扩增得到154 bp大小的条带,与预期片段大小一致,说明待测材料为苜蓿材料,且提取的DNA质量良好,适合于进行PCR检测分析。J163品系特异性PCR扩增得到241 bp大小的条带,与预期片段大小一致,说明待测材料的基因组中存在J163品系特异性片段,为转基因J163品系苜蓿材料。见图1、图2。
图1. ACC基因PCR电泳图。M:DL2000分子量标记;2-21泳道为随机抽取的样品1-10,每个样品两个重复;NC:阴性对照;PC:阳性对照;B:空白对照
图2. J163品系特异性基因PCR电泳图。M:DL2000分子量标记;2-21泳道为随机抽取的样品1-10,每个样品两个重复;NC:阴性对照;PC:阳性对照;B:空白对照
将J163品系特异性PCR扩增的产物测序,与抗除草剂苜蓿J163转化体特异性序列进行比对。测序结果见图3,经与《农业部2122号公告-6-2014转基因植物及其产品成分检测耐除草剂苜蓿J163及其衍生品种定性PCR方法》中给出的J163转化体特异性序列比对,扩增片段与抗除草剂苜蓿J163转化体特异性序列的同源性达100%。
依据检验检疫行业标准SN/T 1204-2016《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》中规定的实时荧光PCR方法对苜蓿种子进行检测。实验结果显示pFMV35S、CTP2-CP4-EPSPS、tE9基因均有明显的扩增曲线,pCaMV 35S、tNOS、NPTII基因均无明显扩增曲线,进一步证实该材料为转基因苜蓿J163品系,但不含有其它已知的转基因成分。
以20 mg、50 mg、100 mg样品粉末为起始取样量提取的总DNA均能够扩增出241 bp大小的条带,与J163品系特异性片段大小一致,稀释10倍后的总DNA模板也可以清晰扩增出预期大小的条带,见图3。因此确定本研究标准样品最小取样量为20 mg。
图3. 不同样品取样量的PCR扩增图。1、2为20 mg样品;3、4为50 mg样品;5、6为100 mg样品;7、8为20 mg样品稀释10倍;9、10为50 mg样品稀释10倍;11、12为100 mg样品稀释10倍;M:100 bp ladder;B:空白对照;N:阴性对照
样品均匀性检测结果见图4,随机抽取的10个样品,每个样品设置2个重复进行J163品系特异性PCR扩增,电泳检测扩增结果。所有样品 J163品系特异性序列均得到扩增,且PCR扩增片段大小与预期片段大小一致,扩增得到241 bp大小的条带且条带亮度相似,表明样品均匀性良好,满足标准样品对均匀性的要求。
样品短期运输稳定性检测结果见表1,结果表明标准样品在37℃、室温、4℃和−20℃储存8周后,PCR检测仍为转基因苜蓿J163品系阳性,说明冻干粉标准样品在−20℃~37℃的条件下运输均是稳定的。
长期保存稳定性检验结果见表2,结果表明,制备好的标准样品在−20℃、4℃储存24个月,PCR检测仍为转基因苜蓿J163品系阳性,说明冻干粉标准样品可于−20℃、4℃稳定储存24个月。
图4. 均匀性检测PCR电泳图。M:DL2000分子量标记;2-21泳道为随机抽取的1-10号样品,每个样品两个重复;NC:阴性对照;PC:阳性对照;B:空白对照
时间(周) | 37℃ | 室温 | 4℃ | −20℃ |
---|---|---|---|---|
0 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 |
2 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 |
4 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 |
8 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 |
表1. 转基因苜蓿J163品系短期稳定性结果
时间(月) | −20℃ | 4℃ |
---|---|---|
0 | 阳性 | 阳性 |
1 | 阳性 | 阳性 |
3 | 阳性 | 阳性 |
6 | 阳性 | 阳性 |
12 | 阳性 | 阳性 |
18 | 阳性 | 阳性 |
24 | 阳性 | 阳性 |
表2. 转基因苜蓿J163品系长期稳定性结果
制备的标准样品经8家权威实验室进行协同定值验证,转基因苜蓿J163品系均为阳性,与研制单位的检测结果相一致,表明该标准样品可用于转基因苜蓿J163品系检测技术的质量控制、检测试剂的验证和评价,实验室能力验证活动。
转基因生物标准物质是具有一种或多种足够均匀和很好确定的特性值(转基因成分或含量),在转基因产品检测中用以校准测量装置、评价测量方法或给材料赋值的一种材料或物质 [
转基因基体标准样品是由原始的植物材料(种子、叶片等)制成,是发展最早且应用最广泛的一类标准样品,因其特性与实际检测中的未知样品的特性相近,具有更高的可靠性和准确性 [
原质检总局科技计划项目(2017IK142)。
梁新苗,郭铮蕾,张宇含,张瑞峰,刘若思. 转基因苜蓿J163品系定性标准样品的研制Development of Qualitative Reference Material of Genetically Modified Alfalfa Event J163[J]. 植物学研究, 2022, 11(02): 143-149. https://doi.org/10.12677/BR.2022.112018