六价铬是铬残留物中的主要有害物质,铬污染场地的修复一直是重金属污染控制领域的重要研究课题。生物修复技术是一种用于处理铬污染场地的环保技术。本研究利用从胜利油田油污土壤中分离出一株可耐受高浓度六价铬[Cr(VI)]抗性菌株,进行16S rDNA测序和数据库比对后,将其命名为微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila) 4-1。针对初始Cr(VI)浓度、菌液接种量、土壤含水率和葡萄糖添加量等因素对土壤环境中Cr(VI)去除率的影响进行了研究。并采用响应曲面法对上述因素的交互影响进行了优化,得出在土壤含水率为28.6%、菌液接种量为4.53 mL以及葡萄糖添加量为5.97%时,Cr(VI)最佳去除率为85.0%。研究结果表明微嗜酸寡养单胞菌4-1是铬污染场地生物修复的优秀菌源。 Hexavalent chromium is the main harmful substance in chromium residues, and the remediation of chromium-contaminated sites has always been an important research topic in the field of heavy metal pollution control. Bioremediation is an environmentally friendly technology for treating chromium-contaminated sites. In this study, a high-concentration hexavalent chromium [Cr(VI)]-resistant strain was isolated from oily soil in Shengli Oilfield, and named after 16S rDNA sequencing and database comparison, Stenotrophomonas acidaminiphila 4-1. The effects of initial Cr(VI) concentration, bacterial inoculum amount, soil moisture content and glucose addition on the removal rate of Cr(VI) in soil were studied. The interaction of the above factors was optimized by the response surface method, and it was concluded that when the soil water content was 28.6%, the bacterial solution inoculum was 4.53 mL, and the glucose addition was 5.97%, the optimal removal rate of Cr(VI) was as follows: 85.0%. The results showed that Stegotrophomonas acidaminiphila 4-1 was an excellent bacterial source for the bioremediation of chromium-contaminated sites.
六价铬是铬残留物中的主要有害物质,铬污染场地的修复一直是重金属污染控制领域的重要研究课题。生物修复技术是一种用于处理铬污染场地的环保技术。本研究利用从胜利油田油污土壤中分离出一株可耐受高浓度六价铬[Cr(VI)]抗性菌株,进行16S rDNA测序和数据库比对后,将其命名为微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila) 4-1。针对初始Cr(VI)浓度、菌液接种量、土壤含水率和葡萄糖添加量等因素对土壤环境中Cr(VI)去除率的影响进行了研究。并采用响应曲面法对上述因素的交互影响进行了优化,得出在土壤含水率为28.6%、菌液接种量为4.53 mL以及葡萄糖添加量为5.97%时,Cr(VI)最佳去除率为85.0%。研究结果表明微嗜酸寡养单胞菌4-1是铬污染场地生物修复的优秀菌源。
六价铬,土壤修复,微嗜酸寡养单胞菌,重金属污染
Xiaojie Sun1, Ying Zhang1, Xuehan Wang1, Xianchao Jia1, Xinfeng Xiao1,2, Hongge Gao1,2, Lin Li1,2*
1College of Safety and Environmental Engineering, Shandong University of Science and Technology, Qingdao Shandong
2Institute of Yellow River Delta Earth Surface Processes and Ecological Integrity, Shandong University of Science and Technology, Qingdao Shandong
Received: Feb. 26th, 2022; accepted: Mar. 31st, 2022; published: Apr. 8th, 2022
Hexavalent chromium is the main harmful substance in chromium residues, and the remediation of chromium-contaminated sites has always been an important research topic in the field of heavy metal pollution control. Bioremediation is an environmentally friendly technology for treating chromium-contaminated sites. In this study, a high-concentration hexavalent chromium [Cr(VI)]-resistant strain was isolated from oily soil in Shengli Oilfield, and named after 16S rDNA sequencing and database comparison, Stenotrophomonas acidaminiphila 4-1. The effects of initial Cr(VI) concentration, bacterial inoculum amount, soil moisture content and glucose addition on the removal rate of Cr(VI) in soil were studied. The interaction of the above factors was optimized by the response surface method, and it was concluded that when the soil water content was 28.6%, the bacterial solution inoculum was 4.53 mL, and the glucose addition was 5.97%, the optimal removal rate of Cr(VI) was as follows: 85.0%. The results showed that Stegotrophomonas acidaminiphila 4-1 was an excellent bacterial source for the bioremediation of chromium-contaminated sites.
Keywords:Hexavalent Chromium, Soil Remediation, Stenotrophomonas acidaminiphila, Heavy Metal Pollution
Copyright © 2022 by author(s) and Hans Publishers Inc.
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铬是地壳中含量分布较广的金属元素之一,是一种重要且广泛使用的基础材料,用于金属电镀、合金制造、皮革鞣制、木材防腐和陶瓷制造等 [
生物强化修复铬污染的土壤是指向土壤中投加从自然界中筛选富集出的优势耐受种群或通过基因工程构造的高效降解菌种,利用其新陈代谢活动将六价铬转化为三价铬,达到降低土壤毒性的目的,有原位修复和异位修复两种操作类型。与物理化学修复技术相比,生物修复技术具有成本低、处理效果好、无二次污染等优势 [
微生物修复技术在修复过程中不仅可以保持土壤原本的结构和理化性质,还能够最大限度地降低六价铬的浓度且处理成本较低,但是利用微生物去除土壤中的重金属污染物有诸多优点,在实际应用上仍存在一定的问题,各种微生物还原六价铬的方式和速率都不相同,并会受到温度、pH值等环境因素的影响。因此需要选择合适的微生物进行有针对性地高效修复且保证修复期间环境因素的适宜。实验室中筛选出的菌株能否在自然环境中发挥作用,是生物强化修复技术成功的关键。本实验选取从胜利油田污染土壤筛选出的微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila) 4-1,开展菌株4-1去除土壤中Cr(VI)的潜力的研究,以及单因素优化的工艺条件,并采用响应面优化法确定了菌株4-1对土壤中六价铬去除的最优条件及最大去除率,为铬Cr(VI)污染土壤修复应用提供了工艺参数调控基础,为后续微生物实际场地的修复技术的优化提供理论依据。
重铬酸钾、氯化钠、葡萄糖、硫酸、磷酸、胰蛋白胨、硝酸、碳酸钠、氯化镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾(均由国药集团化学试剂有限公司生产);无水乙醇(天津市汇杭化工科技有限公司);丙酮(成都市科隆化学品有限公司);氢氧化钠(麦克林试剂公司);二苯碳酰二肼(天津市致远化学试剂有限公司);酵母粉(上海源叶生物科技有限公司)所有试剂均为分析纯。
AL104型电子天平:梅特勒–托利多仪器(上海)有限公司;721型可见分光光度计:上海舜宇恒平科学仪器有限公司;DHG-9053J型精密恒温鼓风干燥箱:上海三发科学仪器有限公司;SHZ-82型恒温振荡器:常州智博瑞仪器制造有限公司;SPX型生化培养箱:宁波市科技园区新江南仪器有限公司;D3024R型高速冷冻微量离心机:大龙兴创实验仪器有限公司;YXQ-LS-18SI型手提式压力蒸汽灭菌器:上海市申按医疗器械厂;HC-3018型高速离心机:安徽中科中佳科学仪器有限公司。
供试菌株为从铬污染的土壤中分离得出的一株六价铬抗性菌,经鉴定为微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)编号为4-1,其分类地位是变形菌门、丙型变形菌纲、黄胞单菌目、黄胞单菌科、寡养单胞菌属,该菌于2019年1月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址:中国湖北省武汉大学),保藏号为:CCTCC M 2019031。
LB (Luria-Bertani)液体培养基及LB (Luria-Bertani)固体培养基的配置方法参照参考文献 [
在LB固体培养基上对菌株4-1进行活化。挑取单菌落到LB液体培养基中,然后在恒温摇床中30℃、160 r/min过夜培养,待生长至对数期后作为种子液用于接种。
采样方法:在1 m2内采用五点取样法,采样时先铲去地表植物、枯叶和2 cm左右的表层土后,挖取土壤,采样深度为7~10 cm。除杂、风干、过10目筛后装袋,室温下干燥保存,备后续实验使用。
进行单因素试验,调节土壤中的初始六价铬浓度、土壤含水率、菌液接种量和葡萄糖浓度四种主要的影响因素。
1) 土壤理化性质测定方法
土壤理化性质(土壤含水率、pH值、有机质、速效磷、本底铬)由国际统一标准方法测定。
2) 土壤中六价铬的测定
土壤中六价铬的测定参照《土壤和沉积物 六价铬的测定 碱溶液提取——火焰原子吸收分光光度法(HJ1082-2019)》。
3) Cr(VI)去除率的分析计算方法
调节25 g的土样中Cr(VI)的浓度分别为0 mg∙g−1、0.2 mg∙g−1、0.3 mg∙g−1、0.7 mg∙g−1、1.0 mg∙g−1、3.0 mg∙g−1、10.0 mg∙g−1,菌4-1接种量为3 mL。所有实验均在30℃的恒温振荡器中培养7天。之后样品用碱溶液提取——火焰原子吸收分光光度法测定吸光度。用测定的标准曲线(R2 = 0.9993)计算Cr(VI)去除率。因此,Cr(VI)去除效率的百分比为 [
Cr(VI)去除率 = C 1 − C 2 C 1 × 100 ( % ) (1)
其中C1和C2分别为生物去除实验中的Cr(VI)对照浓度和最终浓度。
实验所采用的模拟铬污染土壤的基本理化性质见表1。该土壤呈弱酸性,有机质含量为9.3%,速效磷含量为13.89 mg∙Kg−1,土壤中的重金属本底铬含量约为3.135~3.334 μg∙g−1。在模拟铬污染实验中,将会向该土壤中添加一定量的重铬酸钾溶液以调节所需的不同土壤Cr(VI)浓度。
由国标方法测定的土壤理化性质结果如下表1:
含水率(%) | pH | 有机质(g∙Kg−1) | 速效磷(mg∙Kg−1) | 本底铬(μg∙g−1) |
---|---|---|---|---|
2.24 | 6.55 | 9.30 | 13.89 | 3.135~3.334 |
表1. 土壤理化性质
由图1可见,随着六价铬浓度的增加,菌株4-1的去除效果呈现逐渐降低的趋势,说明该菌发挥其作用是有一定初始浓度范围,在六价铬浓度为0.2~1.0 mg∙g−1时去除效果均可达40.0%以上。六价铬浓度过高会导致4-1菌株失活或失效。目前铬渣污染表层土六价铬浓度最高可达10 mg∙g−1 [
图1. 不同初始Cr(VI)浓度对菌株4-1去除六价铬的影响
向土壤中的某一区域投加外源菌株后,菌株虽然不一定能够一直生存在土壤中,但是仍然会对土壤中的优势种群造成一定的影响 [
图2. 不同菌液接种量对菌株4-1去除六价铬的影响
在微生物修复的过程中,会受到诸多环境因素如含水率等的影响。土壤中的水分可以用来维持土壤中微生物的活性,含水率会影响微生物对养分的利用率以及其生理活动 [
图3. 不同土壤含水率对菌株4-1去除六价铬的影响
据报道,电子供体有利于微生物去除Cr(VI) [
为探讨各种因素对Cr(VI)去除率的交互作用,根据上述实验结果,对四个影响因素(初始六价铬浓度、菌液接种量、含水率和葡萄糖添加量)进行主成分分析(PCA)。使用SPSS 22.0软件进行。然后对四个主要因素的贡献率的比率进行加权求和,得到一个综合系数如下 [
Factor = VE 1 VE 1 + VE 2 × Factor 1 + VE 2 VE 1 + VE 2 × Factor2 (2)
其中VE1和VE2分别代表因子1和因子2解释的方差。
图4. 不同葡萄糖投加量对菌株4-1去除六价铬的影响
在分析确定影响最大的因素后,利用Design Expert 8.0软件构建Cr(VI)去除率响应面模型,分析模型参数的显着性和相关性 [
在进行Kaiser-Meyer-Olkin (KMO)检验时,发现数据的KMO值为0.537,大于标准的0.500,表明该数据适合进行因子分析。表2(a)总结了因子贡献率结果。前两个因子的特征值分别为1.321和1.003,均大于1,前两个因子的特征值之和占总特征值的58.110%。因此,前两个因素被提取为主要因素。使用SPSS [表2(b)]获得因子1和因子2的分数。然后使用等式(2)获得综合因子。四个因素的得分表现出以下顺序:含水率 > 接种量 > 葡萄糖浓度 > Cr(VI)浓度。因此,选择了土壤含水率(A)、菌液接种量(B)和葡萄糖浓度(C)三个因素,实验设计的变量水平见表3。
在方差分析(ANOVA;表4)中,F值表示不同组中因子均方与同一组中因子均方的比值。模型的F值和P值分别为134.24和<0.0001,表明回归模型高度显着(P < 0.01)。失拟项的F值和P值分别为0.3424和0.7974,均不显着,表明该模型可用于优化土壤中六价铬的去除。通过方差分析,各因素对六价铬去除率的影响顺序为:接种量 > 葡萄糖浓度 > 含水率。
成份 | 初始特征值 | 提取平方和载入 | 旋转平方和载入 | ||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
合计 | 方差的% | 累积% | 合计 | 方差的% | 累积% | 合计 | 方差的% | 累积% | |
1 | 1.321 | 33.023 | 33.023 | 1.321 | 33.023 | 33.023 | 1.321 | 33.022 | 33.022 |
2 | 1.003 | 25.086 | 58.110 | 1.003 | 25.086 | 58.110 | 1.004 | 25.088 | 58.110 |
3 | 0.930 | 23.262 | 81.372 | ||||||
4 | 0.745 | 18.628 | 100.000 |
表2. Cr(VI)去除率的因素分析:(a) 总方差解释;(b) 得分和排名
因子 | 水平 | ||
---|---|---|---|
−1 | 0 | 1 | |
A (含水率,%) | 15 | 25 | 35 |
B (接种量,mL) | 1 | 3 | 5 |
C (葡萄糖浓度,%) | 3 | 5 | 7 |
表3. 实验设计的变量水平
平方和 | 自由度 | 均方根 | F值 | P值 | 重要性 | |
---|---|---|---|---|---|---|
模型 | 2595.19 | 9 | 288.35 | 134.24 | <0.0001 | significant |
A | 30.34 | 1 | 30.34 | 13.92 | 0.0074 | |
B | 1275.13 | 1 | 1275.13 | 584.79 | <0.0001 | |
C | 149.13 | 1 | 149.13 | 68.39 | <0.0001 | |
AB | 15.29 | 1 | 15.29 | 7.01 | 0.0330 | |
AC | 7.62 | 1 | 7.62 | 3.49 | 0.1038 | |
BC | 10.43 | 1 | 10.43 | 4.78 | 0.0649 | |
A2 | 91.28 | 1 | 91.28 | 41.86 | 0.0003 | |
B2 | 878.68 | 1 | 878.68 | 402.98 | <0.0001 | |
C2 | 64.40 | 1 | 64.40 | 29.54 | 0.0010 | |
Residual | 15.26 | 7 | 2.18 | |||
Lack of fit | 3.12 | 3 | 1.04 | 0.3424 | 0.7974 | not significant |
Pure error | 12.14 | 4 | 3.04 | |||
Cor total | 2610.45 | 16 |
表4. 响应面二次模型的方差分析
如图5所示,Cr(VI)去除率受菌液接种量、葡萄糖浓度和土壤含水率的显着影响。以菌液接种量为例,Cr(VI)去除率随着菌液接种量的增加先上升后降低。使用Design Expert,确定在土壤含水率为28.6%、菌液接种量为4.53 mL以及葡萄糖添加量为5.97%时,可预计最佳Cr(VI)去除率为85.0%。
图5. 土壤含水率、菌液接种量和葡萄糖浓度对土壤中六价铬去除率的响应面图
微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila) 4-1在模拟的受Cr(VI)污染的土壤中表现了卓越去除效率。通过对初始六价铬浓度、土壤含水率、菌液接种量和葡萄糖浓度进行单因素实验可知,四种影响因子对菌株4-1去除土壤中六价铬能力均有一定程度的影响。并利用主成分分析,对影响土壤中六价铬去除的四种因子进行排序,可知各因素对六价铬去除率的影响顺序为:含水率 > 接种量 > 葡萄糖浓度 > Cr(VI)浓度。根据响应曲面优化结果可知,在土壤含水率为28.6%、菌液接种量为4.53 mL以及葡萄糖添加量为5.97%时,最佳Cr(VI)去除率为85.0%。研究结果表明,微嗜酸寡养单胞菌4-1可作为生物修复铬污染土壤的高活性候选菌株。
作者感谢山东省自然科学基金(ZR2019BD035);石油污染控制国家重点实验室开放课题(批准号:PPC2017020),中国石油安全与环境技术研究院;山东科技大学科研基金引进人才项目(批准号:2016RCJJ016)。
孙小杰,张 迎,王雪寒,贾宪超,肖新峰,高洪阁,李 琳. 微嗜酸寡养单胞菌4-1对Cr(VI)污染土壤的修复研究 Remediation of Cr(VI)-Contaminated Soil by Stenotrophomonas acidaminiphila 4-1[J]. 环境保护前沿, 2022, 12(02): 158-168. https://doi.org/10.12677/AEP.2022.122021