目的:研究kiss-1基因在宫颈癌SiHa细胞增殖活力和侵袭迁徙能力中发挥的作用机制,以便为宫颈癌的治疗提供新的靶点。方法:选取kiss-1基因过表达后稳定转染SiHa宫颈癌细胞。本实验分为3组。1) 空白组为常规宫颈癌SiHa细胞;2) 空载体组为转染空载体的宫颈癌SiHa细胞;3) 过表达组为转染稳定kiss-1基因的宫颈癌SiHa细胞。Western blot法分析3组kiss-1基因蛋白的表达量差异,CCK-8测出3组细胞增殖活力,Transwell模型测3组细胞侵袭能力和转移能力。结果:过表达组kiss-1基因蛋白表达量最高,过表达组中Ecadherin的表达是明显上调(P < 0.05),相反Vimentin的表达明显下调(P < 0.05)。转染kiss-1基因的过表达组细胞增殖活力明显低于其他两组(P < 0.05),尤其在12小时的穿膜细胞个数计数方面,转染kiss-1基因过表达组的个数显著高于其他两组(P < 0.05)。转染kiss-1基因的过表达组可明显的抑制宫颈癌SiHa细胞的侵袭能力和转移能力。结论:kiss-1基因过表达能显著抑制宫颈癌疾病侵袭转移。 Objective: To study the mechanism of Kiss-1 in the proliferation and invasion of cervical cancer SiHa cell, and analyze the relative mechanism to supply effective therapy targets to cervical cancer. Methods: Kiss-1 over expression plasmid was transfected into cervical cancer cell lines of SiHa. There were three groups. 1) SiHa control; 2) Treated with empty vector; 3) Treated with kiss-1 gene vector. Western blot analysis of three groups kiss-1 gene protein expression, cell proliferation via-bility was measured by CCK-8, and cell invasion ability and metastasis ability in the transwell model. Results: After transfection of pEGFPC1/Kiss-1 into cervical cancer cell lines of SiHa (over-express group), the protein of kiss-1 was highest, the expression of E-cadherin was significantly higher (P < 0.05); however, the expression of Vimentin was significantly lower than other groups (P < 0.05). Migration ability of the cells in over-expression group was decreased than SiHa control (P < 0.05). The migrating cells were obviously decreased than SiHa control at 12 h after transfection of pEGFPC1/Kiss-1 into SiHa cells (P < 0.05). Over-express group of Kiss-1 could decrease the invasion ability and metastasis ability of cervical cancer SiHa. Conclusion: Over-express of Kiss-1 gene could decrease the potential of invasion and metastasis of cervical cancer.
目的:研究kiss-1基因在宫颈癌SiHa细胞增殖活力和侵袭迁徙能力中发挥的作用机制,以便为宫颈癌的治疗提供新的靶点。方法:选取kiss-1基因过表达后稳定转染SiHa宫颈癌细胞。本实验分为3组。1) 空白组为常规宫颈癌SiHa细胞;2) 空载体组为转染空载体的宫颈癌SiHa细胞;3) 过表达组为转染稳定kiss-1基因的宫颈癌SiHa细胞。Western blot法分析3组kiss-1基因蛋白的表达量差异,CCK-8测出3组细胞增殖活力,Transwell模型测3组细胞侵袭能力和转移能力。结果:过表达组kiss-1基因蛋白表达量最高,过表达组中Ecadherin的表达是明显上调(P < 0.05),相反Vimentin的表达明显下调(P < 0.05)。转染kiss-1基因的过表达组细胞增殖活力明显低于其他两组(P < 0.05),尤其在12小时的穿膜细胞个数计数方面,转染kiss-1基因过表达组的个数显著高于其他两组(P < 0.05)。转染kiss-1基因的过表达组可明显的抑制宫颈癌SiHa细胞的侵袭能力和转移能力。结论:kiss-1基因过表达能显著抑制宫颈癌疾病侵袭转移。
Kiss-1基因,宫颈癌,侵袭,转移
Ouyi Song, Li Wang, Su Jiang, Jinhong Zhou, Buqin Yang
Bao’an District People’s Hospital of Shenzhen City, Shenzhen Guangdong
Received: Apr. 27th, 2022; accepted: May 21st, 2022; published: May 30th, 2022
Objective: To study the mechanism of Kiss-1 in the proliferation and invasion of cervical cancer SiHa cell, and analyze the relative mechanism to supply effective therapy targets to cervical cancer. Methods: Kiss-1 over expression plasmid was transfected into cervical cancer cell lines of SiHa. There were three groups. 1) SiHa control; 2) Treated with empty vector; 3) Treated with kiss-1 gene vector. Western blot analysis of three groups kiss-1 gene protein expression, cell proliferation viability was measured by CCK-8, and cell invasion ability and metastasis ability in the transwell model. Results: After transfection of pEGFPC1/Kiss-1 into cervical cancer cell lines of SiHa (over-express group), the protein of kiss-1 was highest, the expression of E-cadherin was significantly higher (P < 0.05); however, the expression of Vimentin was significantly lower than other groups (P < 0.05). Migration ability of the cells in over-expression group was decreased than SiHa control (P < 0.05). The migrating cells were obviously decreased than SiHa control at 12 h after transfection of pEGFPC1/Kiss-1 into SiHa cells (P < 0.05). Over-express group of Kiss-1 could decrease the invasion ability and metastasis ability of cervical cancer SiHa. Conclusion: Over-express of Kiss-1 gene could decrease the potential of invasion and metastasis of cervical cancer.
Keywords:Kiss-1, Cervical Cancer, Invasion, Migration
Copyright © 2022 by author(s) and Hans Publishers Inc.
This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0).
http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
宫颈癌是女性恶性肿瘤的第二大杀手,近些年其发病率趋于年轻化,病死率也处于上升态势 [
使用购自于北京中国科学院细胞库的宫颈癌细胞SiHa,用百分之十的胎牛血清和100 U/ml青霉素链霉素的培养基进行宫颈癌SiHa细胞培养,置于培养箱维持37摄氏度,每隔1天更换新鲜培养基。充分胰蛋白酶消化,并收集细胞进行传代。实验选取的细胞均保证为对数生长期的宫颈癌细胞。
KISS-1、E-cadherin、Vimentin及β-actin单克隆抗体均是美国Santa Cruz公司产品,碱性磷酸酶(AP)标记鼠抗兔二抗IgG是美国Jackon公司产品。Transwell 6孔板和96孔板均是美国Corning公司产品,PCR试剂盒子为美国Qiagen公司产品,脂质体是美国Invitrogen公司产品,matrigel胶是BD公司产品,PCR引物序列由上海英骏生物技术有限公司合成。
细胞分为3组:SiHa细胞组(空白组)、转染空载体的 SiHa细胞组(空载体组)及转染Kiss-1基因的SiHa细胞组(过表达组)。
1) 依据kiss-1 (AY117143.1)基因序列,引入上下游双酶切位点HinDIII和酶切位点BamH I,设计kiss-1基因全长,并进行扩增引物PCR。提取SiHa宫颈癌细胞系中总RNA,然后将SiHa RNA逆转录成SiHa cDNA。PCR反应条件为:95摄氏度维持2分钟,94摄氏度维持30秒,63度维持30秒,82度维持1分钟,82度维持10分钟,总共为30个循环。使用PCR产物进行凝胶电泳,使用PCR试剂盒纯化PCR,与HinDIII和BamH I酶切后的载体粘端先后进行连接,然后转化并测序,最终得到pEGFPC1/kiss-1过表达载体。kiss-1全长表达引物序列如下:上游: 5'-ggcagctactgcttttcct-3',下游:5'-agtagcagctggcttcctc-3'。将pEGFPC1 (空载体组)、pEGFPC1/kiss-1 (过表达组)转入宫颈癌细胞SiHa。以常规宫颈癌细胞SiHa作为空白组。
2) Western blot方法检测kiss-1基因蛋白表达,并提取3组SiHa细胞蛋白质。分别用3组SiHa细胞50 μg蛋白样品,用百分之十的SDS-PAGE凝胶进行电泳分离,转移相应的蛋白到PVDF膜上,用百分之五的脱脂奶维持37度封闭1至1.5小时,3组分别加相应的一抗维持4摄氏度进行孵育过一整夜。取百分之0.05 Tween20的缓冲液一共充分漂洗3次,每次维持5分钟,用碱性磷酸酶(AP)来标记二抗(浓度1:1000稀释)维持37摄氏度情况下共孵育1小时,TBST洗膜3次,每次维持10分钟,然后加入底物,采用(NBT或者BCIP)显色,使用化学发光法和ChemiImager 5500软件进行结果分析,每组别需要重复3次。
3) 将3组宫颈癌SiHa细胞用胰酶消化后分别计数,细胞需要维持在1 × 105个每毫升的密度,在96孔板中加入100 μl宫颈癌SiHa细胞悬液,保证每孔至少有1 × 104个宫颈癌SiHa细胞,切记每组需要设计平行副孔,并且至少需要设计5个孔,分别在不同的时间点(24 h、36 h、48 h、60 h、72 h)进行检测,置于避光的条件,然后加10 μl的CCK-8检测液,再次置于避光条件孵育时间维持在2 h,用酶标仪检测在450 nm处的吸光度A值,A值的大小为细胞增殖活力。
4) Transwell模型细胞:采用稀释的matrigel胶平铺于Transwell上室,待风干,然后加无血清培养液于Transwell下室,避免有气泡生成,Transwell上室每孔加200 μl,密度要求含10,000个细胞,各组再设3个复孔,持续培养细胞24 h,取出滤膜后用多聚甲醛固定20 min,PBS洗膜2次,待风干后采用结晶紫染色再持续培养细胞15 min,PBS再次彻底洗涤2次,待滤膜完全干后用棉签轻拭上室宫颈癌SiHa细胞,随机选取200倍显微镜下中心5个视野,计穿过滤膜的宫颈癌SiHa细胞数,细胞个数为侵袭和迁移能力。每组设置为3个平行样本,每组均需要重复3次,最后取宫颈癌SiHa细胞数的平均值。
使用spss21.0统计软件分析,各组样本均数比较均采用单因素方差分析,所有实验结果均表示为均值±标准差,组间两两比较采用t检验,以P < 0.05表示差异有统计学意义。
选取β-actin为内参,转染kiss-1基因过表达kiss-1后宫颈癌SiHa细胞中Ecadherin的表达较空载体组有明显上调,同时Vimentin的表达则明显显著下调。(P < 0.05)见图1,表1。
图1. Western blot法检测转染kiss-1过表达组对kiss-1、E-cadherin、Vimentin蛋白表达的影响
组别 | kiss-1 | Ecadherin | Vimentin |
---|---|---|---|
空白组 | 0.743 ± 0.080 | 1.280 ± 0.102 | 1.250 ± 0.087 |
空载体组 | 0.762 ± 0.074 | 1.236 ± 0.097 | 1.292 ± 0.102 |
过表达组 | 1.491 ± 0.102 | 1.518 ± 0.088 | 0.466 ± 0.093 |
表1. SiHa 细胞不同处理组kiss-1、E-cadherin和Vimentin的蛋白表达( x ¯ ± s )
转染kiss-1后过表达组细胞增殖活力低于空载体组和SiHa空白组(P < 0.05),而空载体组和SiHa空白组细胞增殖活力比较差异无统计学意义(P > 0.05),见图2。
以穿过Matrigel侵袭膜的细胞平均数表示肿瘤细胞的体外侵袭能力。图3示SiHa细胞中转染kiss-1过表达组与空载体组相比,穿膜细胞数明显减少。SiHa细胞空白组、空载组及过表达组,12 h穿膜细胞数分别为275 ± 11、269 ± 15、115 ± 7,前两组细胞数无显著性差异,转染kiss-1过表达组与前两组相比有显著性差异(P < 0.05),见图3。
上皮细胞向间质细胞的转化过程称为EMT,整个过程中随着细胞极性消失和黏附性减弱,而且其丝
图2. CCK-8法检测各组细胞不同时间的增殖活力
图3. Transwell模型反映各组宫颈癌细胞SiHa侵袭转移能力
状肌动蛋白重新排列,丝状和片状伪足形成从而获得迁移与侵袭的能力,进而最终称为间质细胞。肿瘤细胞的侵袭和转移已经在多项研究中证明与细胞间EMT相关 [
未来在裸鼠模型上可以进一步验证kiss-1基因在哺乳动物的宫颈癌转移的过程,选用更接近人类的裸鼠敲基因模型更直观,更能验证试验的有效性。Kiss-1基因未来或可成为真正防治宫颈癌转移的靶基因。
深圳市宝安区医疗卫生基础研究项目(2019JD030)。
宋欧诣,王 丽,江 速,周金红,杨步琴. Kiss-1抑制宫颈癌细胞增殖和侵袭的作用机制Mechanism of Kiss-1 Inhibiting Proliferation and Invasion of Cervical Cancer Cells[J]. 临床医学进展, 2022, 12(05): 4599-4605. https://doi.org/10.12677/ACM.2022.125664