目的;鉴定环青海湖地区紫花苜蓿根瘤内细菌组成的多样性。方法:试验以环青海湖地区紫花苜蓿根瘤作为供试材料,刚果红YMA培养基通过平板划线法进行细菌培养,进行分子鉴定。结果:共分离出14株菌株,分别属于苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis strain)、假单胞菌(Pseudomonas kilonesis)以及桃色欧文氏菌(Erwinia persicina)。结论:表明环青海湖地区紫花苜蓿根瘤内细菌具有多样性,本研究不仅拓展了紫花苜蓿根瘤内细菌多样性的研究方法,还为寄主植物根际促生菌的研究提供了分析思路。 Objective: To identify the diversity of bacterial composition in alfalfa root nodules around Qinghai Lake. Method: Alfalfa root nodules from Qinghai Lake area were used as test materials, and Congo red YMA medium was used for bacterial culture by plate streak method, and molecular identification was carried out. Results: A total of 14 strains were isolated. They belong to Sinorhizobium meliloti, Bacillus Subtilis strain, Pseudomonas kilonesis and Erwinia persicina. Conclusion: This study not only expanded the research method of bacterial diversity in alfalfa root nodule, but also provided an analytical idea for the study of rhizosphere growth promoting bacteria of host plants.
目的;鉴定环青海湖地区紫花苜蓿根瘤内细菌组成的多样性。方法:试验以环青海湖地区紫花苜蓿根瘤作为供试材料,刚果红YMA培养基通过平板划线法进行细菌培养,进行分子鉴定。结果:共分离出14株菌株,分别属于苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis strain)、假单胞菌(Pseudomonas kilonesis)以及桃色欧文氏菌(Erwinia persicina)。结论:表明环青海湖地区紫花苜蓿根瘤内细菌具有多样性,本研究不仅拓展了紫花苜蓿根瘤内细菌多样性的研究方法,还为寄主植物根际促生菌的研究提供了分析思路。
紫花苜蓿,根瘤,分离培养,16S rDNA鉴定
Huilin Yan, Yanhui Qi, Hengrui Gou, Xuefei Li, Guangxin Lu*
Qinghai University, Xining Qinghai
Received: May 21st, 2022; accepted: Jun. 17th, 2022; published: Jun. 30th, 2022
Objective: To identify the diversity of bacterial composition in alfalfa root nodules around Qinghai Lake. Method: Alfalfa root nodules from Qinghai Lake area were used as test materials, and Congo red YMA medium was used for bacterial culture by plate streak method, and molecular identification was carried out. Results: A total of 14 strains were isolated. They belong to Sinorhizobium meliloti, Bacillus Subtilis strain, Pseudomonas kilonesis and Erwinia persicina. Conclusion: This study not only expanded the research method of bacterial diversity in alfalfa root nodule, but also provided an analytical idea for the study of rhizosphere growth promoting bacteria of host plants.
Keywords:Alfalfa, Nodules, Isolation Culture, 16S rDNA Identification
Copyright © 2022 by author(s) and Hans Publishers Inc.
This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0).
http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
紫花苜蓿属豆科(Leguminosae sp.)蝶形花亚科(Papilionoideae)苜蓿属(Medicago L.)多年生草本植物,是目前世界种植最广泛的一种栽培牧草,在我国已有2000多年的种植历史 [
试验地位于青海省草原改良试验站的牧草育种试验区(37˚03'43.0''N,99˚34'00.6''E,海拔3270米)。年平均气温−0.7℃,绝对无霜期为20 d。年平均降水量为368.11 mm,相对湿度58%,年蒸发量1495.3 mm,土壤为暗栗钙土。于2020年9月在苜蓿种植试验区,随机选取10株紫花苜蓿植株,挖取其根瘤部分,并装入无菌袋中进行保存,并记录好标签带回实验室,于4℃冰箱保存。
参照文献 [
将粉红色饱满的根瘤装于已灭菌的培养皿中,用95%的乙醇浸泡5 min,随后转入0.1%的砷汞1 min,再用无菌水冲洗5~6次,清洗残留消毒液,然后用研钵将根际土壤磨碎,并将根瘤压碎使浆液流出,加入少量无菌水,用接种环蘸取1环菌液,在刚果红YMA培养基上划线,28℃培养24 h获取单菌落,进行革兰氏染色。并于4℃斜面试管保存。
菌株基因组DNA提取 将试管斜面保存的菌落活化后,接种到盛有50 ml液体培养基的250 mL的锥形瓶中,在28℃震荡培养箱中培养,直至瓶内溶液变得浑浊,离心后弃去上清液,用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒。
16S rDNA基因PCR扩增 以细菌通用引物27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R (5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’),进行扩增。
PCR反应体系的配制27F和1402R混合液4.0 μL,2× San Tap PCR Mix (含蓝染液)25.0 μL,模板DNA1.0 μL,双蒸水(ddH2O) 21.0 μL。扩增条件:1) 94℃预变性5 min;2) 94℃变性1 min;3) 57℃退火1 min;4) 72℃延伸90 s;5) 重复步骤2)~4) 30次;5) 72℃延伸15 min;6) 6℃ for ever。PCR产物送上海生物工程有限公司测序,参照文献 [
采用Excel 2020以及IBM SPSS Statistic25软件进行统计分析,用MEGA7.0.26软件作系统发育树,用单因素方差(AVONA)分析其显著性差异。
根据菌落形态进行归类并统一编号,菌株编号分别为SBL 2-1-01、SBL 2-1-02、SBL 9-2、SWL 8-3-01、SWL 8-3-02、SWP 4-3-01、SWP 4-3-02、SWP 5-2、NBL 15-3、NBL 14-4、NWL 17-3、NBP 15-1、NWL 17-3-01、NWL 17-3-02,革兰氏染色和菌落形态观察的结果见表1。
编号 | 革兰氏染色 | 菌落形态 |
---|---|---|
SBL 2-1-01 | G+ | 桃粉色,有光泽,凸起,直径1 mm |
SBL 2-1-02 | G+ | 粉色,表面粗糙,形状不规则,无光泽 |
SBL 9-2 | G+ | 粉色,边缘为土灰色,中央有白圈,直径5 mm |
SWL 8-3-01 | G- | 透明,有光泽,直径9 mm |
SWL 8-3-02 | G+ | 浅粉色,边缘不规则,直径5 mm |
SWP 4-3-01 | G- | 透明,中间粉色圈,有光泽,直径6 mm |
SWP 4-3-02 | G- | 粉圈,中间透明,直径2 mm |
SWP 5-2 | G+ | 粉色,中央颜色较深,表面粗糙,边缘不整齐 |
NBL 15-3 | G- | 白色,凸起,无光泽,直径2 mm |
NBL 14-4 | G+ | 桃粉色,有光泽,凸起,边缘不规则 |
NWL 17-3 | G- | 玫红色,无光泽,直径1 mm |
NBP 15-1 | G+ | 浅粉色,边缘不规则,直径5 mm |
NWL 17-3-01 | G- | 淡黄色,有光泽,直径1 mm |
NWL 17-3-02 | G- | 淡粉,中间玫红色点,凸起,直径3 mm |
表1. 革兰氏染色和菌落形态观察结果
注:G+表示革兰氏阳性;G−表示革兰氏阴性。
将分离得到的14株菌种进行PCR扩增(见图1),扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,待测菌株样品分别用1~14代表,扩增产物均在500~750 bp之间出现特异性条带,将得到条带进行切胶回收,提取DNA,纯化后测序。测序得到的14种微生物的16S rDNA序列,经NCBI上的BLAST在线对比,找出相似菌株如表2所示。
图1. 不同菌株PCR扩增结果
编号 | 相似菌株 | 相似度 | NCBI登录号 |
---|---|---|---|
SBL 2-1-01 | 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp. subtilis) | 98.00% | NR_102783.2 |
SBL 2-1-02 | 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) | 99.57% | NR_112116.2 |
SBL 9-2 | 液化淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) | 99.46% | NR_117946.1 |
SWL 8-3-01 | 桃色欧文氏菌(Erwinia persicina) | 99.18% | NR_041975.1 |
SWL 8-3-02 | 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) | 99.28% | NR_027552.1 |
SWP 4-3-01 | 桃色欧文氏菌(Erwinia persicina) | 99.12% | NR_119365.1 |
SWP 4-3-02 | 桃色欧文氏菌(Erwinia persicina) | 99.36% | NR_114078.1 |
SWP 5-2 | 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis strain) | 99.57% | NR_027552.1 |
NBL 15-3 | 假单胞菌(Pseudomonas kilonesis) | 100.00% | NR_028929.1 |
NBL 14-4 | 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis strain) | 99.54% | NR_075005.2 |
NWL 17-3 | 苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti) | 100.00% | NR_113670.1 |
NBP 15-1 | 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis strain) | 100% | NR_112116.2 |
NWL 17-3-01 | 假单胞菌(Pseudomonas kilonesis) | 99.13% | NR_029042.2 |
NWL 17-3-02 | 桃色欧文氏菌(Erwinia persicina) | 100.00% | NR_114078.1 |
表2. 16SrDNA序列对比结果
对测序得到的14株细菌进行系统发育树的构建,从图2可以看到,这14株菌分别隶属于4个属,分别是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis strain)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、假单胞菌(Pseudomonas kilonesis)、桃色欧文氏菌(Erwinia persicina)。本研究的SWL 8-3-01、NBP 15-1、SBL 2-1-02、SBL 2-1-01、SWP 5-2、NBL 14-4、NWL 17-3-01、NWL 17-3-02菌株与Genbank中的Bacillus subtilis strain聚为一支,八株菌株的亲缘关系非常相近,总支持率达到了100%,被鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis strain)。NWL 17-3 D1菌株与Genbank中的苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)单独聚为1枝,二者关系非常相近,支持率达到了100%,被鉴定为苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)。NBL 15-3菌株与Genbank中的假单胞菌(Pseudomonas kilonesis)单独聚为1枝,说明二者关系相近,支持率达到了100%。SWP 4-3-02、SWL 8-3-01、SWP 4-3-01菌株与Genbank中的桃色欧文氏菌(Erwinia persicina)聚成1枝,总支持率达到了100%,但是SWL 8-3-01和SWP 4-3-01两菌株的支持率只有57%。
图2. 最大似然法分子系统发育分析
紫花苜蓿是一种多年生的开花植物,其须根中会形成根瘤,从而促进植株的生长,增强植株营养品质 [
本试验对生长于环青海湖地区的紫花苜蓿根瘤内细菌多样性进行了研究。研究结果表明,紫花苜蓿根瘤细菌具有多样性,共分离得到14株菌株。经过形态学观察及16S rDNA鉴定,确定了SWL 8-3-01、NBP 15-1、SBL 2-1-02、SBL 2-1-01、SWP 5-2、NBL 14-4、NWL 17-3-01、NWL 17-3-02菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis strain)。NWL 17-3 D1菌株为苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)。NBL 15-3菌株为假单胞菌(Pseudomonas kilonesis)。SWP 4-3-02、SWL 8-3-01、SWP 4-3-01菌株为桃色欧文氏菌(Erwinia persicina)。
青海省科技厅科技成果转化专项项目,禾/豆混播的微生物调控及菌肥研发(2022-SF-147)。
颜珲璘,祁岩慧,苟恒瑞,李雪飞,芦光新. 紫花苜蓿根瘤微生物组成及16S rDNA鉴定Microbial Composition and 16S rDNA Identification of Alfalfa Root Nodules[J]. 微生物前沿, 2022, 11(02): 135-140. https://doi.org/10.12677/AMB.2022.112016