目的:克隆杨树菇抗肿瘤相关蛋白基因,初步鉴定其活性。方法:构建cDNA文库,随机测序得到杨树菇基因1C10。高通量测序分析其在菌丝体和子实体的差异表达。构建真核表达质粒检测其在HeLa细胞中表达引起的细胞凋亡及衰老的变化,初步鉴定其抗肿瘤活性。结果:得到全长为728 bp的杨树菇基因1C10,编码107个氨基酸,高通量测序分析发现其在子实体中为高表达。在真核细胞中表达会引起肿瘤细胞的凋亡而非衰老。结论:通过构建cDNA文库及测序初步鉴定出具抗肿瘤活性的杨树菇未知基因1C10,为进一步研究其活性及机理奠定基础。 Objective: The antitumor-associated gene of Agrocybe aegerita was cloned to identify the bioactivity. Method: cDNA library was constructed and the gene 1C10 was obtained by random sequencing. The differential ex- pression of the gene was analyzed by high-throughout sequencing. The eukaryotic expression vector was constructed to detect cell apoptosis and senescence activity. Result: The gene of 1C10 was cloned with 728 bp and 107 amino acid residues. The high-throughout sequencing analyse showed that 1C10 was highly expressed in the fruiting body. The expression in HeLa cells could induce the cell apoptosis instead of senescence. Conclusion: 1C10 was identified to have antitumor activity by cDNA library and sequencing, which was fundation for further study.
药用真菌因其独特的药理活性被越来越多的研究者关注[1-3]。其中蛋白质组分占子实体干重约10%~ 40%[
相对于多糖,药用真菌的抗肿瘤活性蛋白研究不足的原因,可能是由于药用真菌基因组信息缺乏,不易克隆蛋白基因序列的缘故。目前随着高通量测序技术的成熟,国内外学者也都致力于对药用真菌基因组的测序工作。2006年,来自19个大学的研究人员组成的团队开始首次对食用菌平菇Pleurotus ostreatus基因测序组的测序,2007年开始对双胞蘑菇Agaricus bisporus的基因组测序,目前这些项目均已完成[
杨树菇(Agrocybe aegerita)子实体由华中农业大学食用菌研究所培育,品种为杨树菇3号,采集之后迅速冷冻于液氮罐中保存。RNA提取试剂盒是Qiagen公司的RNeasy Plant Mini Kit,SMART cDNA Library Construction Kit购于Clontech公司。真核表达载体pGEFP-C1系本实验室保存,HeLa细胞购于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),转染试剂为invitrogen公司的Lipofectamine 2000。衰老相关β-galactosidase检测试剂盒购自上海杰美生物公司,碘化丙锭PI购于武汉大风生物技术有限公司。
使用RNeasy Plant Mini Kit提取杨树菇子实体总RNA,按照SMART cDNA Library Construction Kit说明书构建cDNA文库。即在合成cDNA的反应中事先加入的3'末端带Oligo (dG)的SMART引物,由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA,在到达mRNA的5'末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”,即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个 (dC),SMART引物的Oligo (dG)与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板,逆转录酶会自动转换模板,以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端,这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo (dT)的起始引物序列,另一端有已知的SMART引物序列,合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。由于有5'帽子结构的mRNA才能利用这个反应得到能扩增的cDNA,因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA。
对文库进行随机测序,得到的序列用CodonCode Aligner软件去掉低质量序列、载体序列、重复序列等,用Phrap拼接同源EST,并与NCBI非冗余蛋白库比对(BLASTX)。
提取样品总RNA后,用带有Oligo (dT)的磁珠富集mRNA。加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段,以mRNA为模板,用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链,然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链,在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加poly(A)并连接测序接头,然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择,最后进行PCR扩增,建好的测序文库用Illumina HiSeq™ 2000进行测序。测序得到的原始图像数据经base calling转化为序列数据,结果以fastq文件格式存储,包括reads的序列以及reads的测序质量。
通过引物Forward:ccgaattccatggtcagttctgtcg,reverse:cggggtacctcatgcgatccatggtg,将1C10基因克隆到真核表达载体pGEFP-C1上。HeLa细胞按每孔约3 × 104个细胞接种于6孔细胞培养板,37℃培养过夜,待细胞密度为80%~90%使用Lipofectamine 2000转染真核表达质粒。
按照上述方法转染待质粒,继续培养48 hr。使用荧光显微镜检测转染效率。细胞用PBS重悬洗涤1次,75% 乙醇重悬后,加RNase A (终浓度0.25 mg/ml) 37℃孵育1 hr,终浓度50 mg/ml的碘化丙啶4℃避光染色30 min,流式细胞计数仪检测荧光强度分布(激发波长488 nm)。
按照上述方法转染质粒,使用β-galactosidase衰老相关试剂盒里对细胞进行染色,细胞呈现蓝色部位为衰老细胞特异性酶(β-半乳糖苷酶)活性位点。
应用统计软件SPSS13.0进行数据分析,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验,p < 0.05有统计学意义。
杨树菇cDNA文库构建成功,随机测序获得杨树菇Agrocybe aegerita 1C10序列(如图1所示),长728bp。用NCBI的ORF Finder程序分析其开放阅读框,5’-非翻译区为28 bp,3’-非翻译区376 bp,其中末尾有18 bp的poly-A。含有长324 bp的开放阅读框(包括一个终止密码子),编码107个氨基酸。使用BLASTP搜索数据库,未找到相似度较高的氨基酸序列这一结果表明1C10序列是杨树菇中全新基因。
分别提取杨树菇菌丝体和子实体的总RNA,在华大基因研发中心使用Illimina HiSeq 2000进行测序。原始测序结果进行去除杂质和组装处理,得到尽可能长的非冗余Unigene。将1C10基因与Unigene进行比对,分别得到其在菌丝体和子实体中的reads数分别为5和342,如表1所示。为消除基因长度和测序量差异对计算基因表达的影响[
PCR扩增连在cDNA文库构建质粒载体pDNR-lib上的1C10基因,扩增结果如图2(a),将基因克隆到pEGFP-C1载体上,酶切鉴定结果如图2(b)。真核表达载体构建完成后,用pEGFP-C1空载体作为对照,以相同的量转染入6孔板的HeLa细胞,48小时后通过标签GFP在荧光显微镜下检测转染效率,图2(c)表明转染效率可达80%以上。
使用碘化丙啶染色以及流式细胞仪分析发现,1C10基因的表达可引起HeLa细胞亚二倍体峰细胞群也就是凋亡细胞数目的增多,如图3(a)所示。转染空质粒对照凋亡峰只有2.24%,而1C10基因的表达诱导细胞出现24.6%的亚二倍体峰,说明1C10的表达可显著诱导细胞出现凋亡。
转染质粒48小时后,使用衰老相关β-galactosidase检测试剂盒对细胞进行染色,光学显微镜观察,每个样品随机选取4个视野,计算SA-β-Gal呈阳性反应的细胞比例,统计结果如图3(b)所示,转染1C10基因与对照组相比没有显著性差异。
药用真菌中蛋白组分的研究十分不足,重要原因之一在于其基因信息的缺乏。由于其繁殖特点(有性或无性繁殖,菌丝的异宗结合,不同遗传背景的菌丝纽结成子实体等特点),使得基因克隆非常困难,因此,构建cDNA文库结合表达序列标签分析将有助于获得大量基因信息,从而推动对药用真菌抗肿瘤蛋白的研究。
1C10基因在数据库中未检索到相似度较高的基因,属杨树菇新基因。通过高通量测序的Unigene表
表1. 1C10基因在杨树菇菌丝体(M)和子实体(F)中的差异表达分析
图1. 杨树菇Agrocybe aegerita 1C10基因序列及氨基酸序列
图2. pEGFP-C1-1C10真核质粒构建及转染。(a) 1C10基因扩增; (b) pEGFP-C1-1C10质粒酶切鉴定结果; (c) pEGFP-C1-1C10质粒转染,带有GFP标签的质粒转染HeLa细胞, 48小时后荧光显微镜观察并照相(pEGFP-C1-C)为空载体对照
达差异分析发现,1C10基因在子实体中有高表达,菌丝体中表达量较低。在真核细胞中1C10表达可以引起HeLa细胞的凋亡,该分子的活性及作用机制值得进一步研究。
cDNA文库构建的质量很大程度上反应在重组cDNA片段的序列完整性,要从文库中分离获得目的基因完整的序列和功能信息,要求文库中的重组cDNA片段足够长以便尽可能地反应出天然基因
图3. 检测1C10基因表达对HeLa细胞的影响。(a) 转染质粒48小时后,PI染色结合流式细胞仪检测细胞。pEGFP-C1-C为转入空质粒对照,三次流式试验的统计学数据,**表示p < 0.01; (b) 使用衰老相关β-galactosidase检测试剂盒染色16小时,随机挑选4个视野计数阳性反应即衰老细胞比例的统计数据
的结构。本文使用基于SMART技术构建文库的方法,根据其原理应该是全长的cDNA。由测序结果也看到本实验中构建的cDNA文库比较成功,测序得到的246条EST序列,大部分(>70%都可以找到ORF,以及5’上游的终止密码子以及3’的polyA序列,说明SMART技术是比较成熟的适用于构建全长cDNA文库的方法。
本文通过cDNA文库构建及测序,快速对杨树菇大量基因信息进行分析,并进一步通过构建真核表达质粒,转染入HeLa细胞中,初步筛选到多个具有抗肿瘤活性的基因,包括泛素蛋白酶系统相关分子,及本文的1C10等分子,说明该方法对快速大量地研究未知基因种群的活性蛋白具有优势,值得重视。
感谢国家自然科学基金(No. 81102850),广东省医学科研基金(A2011434),东莞市高等院校科研项目基金(No. 2011108102049)及广东医学院博士启动基金项目(XB1106)给予本研究的支持。
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