采用邻苯三酚自氧化法研究了鄂尔多斯高原碱湖钝顶节旋藻SOD活性的测定条件以及酶的稳定性,为进一步从钝顶节旋藻中提取、纯化SOD酶制剂提供可参考的基础数据。结果显示,SOD在紫外光区320 nm处有最大吸收值;在Tris-HCl缓冲溶液中最适pH值为8.2,最适温度为25℃。该酶的pH值稳定性范围为6~10;在不同温度下保温20 min时,高于40℃时酶活性开始下降,保温60 min时,高于35℃时酶活性开始下降;室温下存放2 d后活性开始下降,7 d时活性基本丧失;室温下避光保存9 d时SOD活性完全丧失。 To obtain the basic data of extracting and purifying the SOD enzyme preparation from Arthrospira, the determination conditions and enzyme stability of Arthrospira SOD in alkaline lake in Erdos plateau were studied by the method of pyrogallol auto-oxidation. The results showed that SOD met its ultimate absorption at 320 nm in UV area. The optimum pH in Tris-HCl buffer was 8.2 and its optimum temperature is 25˚C. This enzyme remained stable in the range of pH = 6 - 10. Its activity began to fall over 40˚C when the enzyme was preserved at different temperature for 20 min, and to fall over 35˚C for 60 min. Enzyme activity began to decline after 2 days and almost nothing at the seventh day at room temperature in light. Its activity lost absolutely at the ninth day when the enzyme was stored at room temperature without light.
钝顶节旋藻(Arthrospira plaensist)是一种光合自养的原核生物,属于蓝藻门(Cyanopyta)、颤藻科(Oscillatoriaceae)、节旋藻属(Arthrospira)[
生物体代谢活动中会产生活性氧,活性氧过多的累积会引起人体包括癌症等许多疾病,正常情况下,人体内活性氧的产生和清除处于一种动态平衡,SOD是生物体内抗氧化系统的重要酶。该酶可以清除体内多余的超氧阴离子,具有抗辐射、防衰老以及防治肿瘤和抗炎等药用功效[
实验材料为钝顶节旋藻,从鄂尔多斯高原察汗淖尔碱湖中采集,经分离纯化后用Zarrouk培养液于室温下每间隔1 h通空气15 min进行培养,于对数生长期取材。
捞取新鲜节旋藻样品,用蒸馏水冲洗数次,滤纸吸取多余水分。按每克鲜藻加入50 mmol/L、pH 7.8磷酸缓冲溶液4 mL,在冰浴中超声波破碎,破碎条件为功率60 w,超声1 s,间隔2 s,共超声15 min。再将破碎液在4℃、10000 × g下离心20 min,取上清液备用。
按李永利等[
波长选择:用分光光度计对邻苯三酚自氧化反应在2 min、4 min、6 min、8 min、10 min时的初始中间产物进行波长扫描,确定吸收峰。
浓度选择:通过控制加样量使反应体系的邻苯三酚溶液终浓度达到0.05 mmol/L、0.10 mmol/L、0.15 mmol/L、0.20 mmol/L、0.25 mmol/L、0.30 mmol/L、0.35 mmol/L、0.40 mmol/L、0.45 mmol/L、0.50 mmol/L、0.55 mmol/L、0.60 mmol/L、0.65 mmol/L、0.70 mmol/L、0.75 mmol/L、0.80 mmol/L,测其自氧化速率与时间的线性关系。
按邻苯三酚自氧化速率测定方法测定酶活性。先加入0.01 mL粗酶液,再加0.01 mL预热过的邻苯三酚溶液,空白对照用蒸馏水代替粗酶液,在320 nm处测A值,共测定4 min。酶活力单位定义为:1 mL反应液中1 min抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量为一个活力单位(U)。单位体积中的酶活力(U/mL)按下式计算:
(A320nm/min为邻苯三酚自氧化速率,B320nm/min为SOD抑制下的邻苯三酚自氧化速率,邻苯三酚自氧化速率需控制在0.07 OD/min左右)。
2.2.4.1. 温度对酶活性的影响及其热稳定性研究
在0℃~70℃范围内(间隔5℃),于不同温度下分别测定SOD活性,观察温度对酶的影响,确定酶的最适温度。
将酶液在0℃~70℃(间隔5℃)范围内分别保温20 min和60 min,再在最适温度下测其活性,确定酶的热稳定性,每项测定至少重复3次。
2.2.4.2. pH对酶活性的影响及其稳定性
在pH 6.8、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0的磷酸盐-Tris-HCl缓冲液中分别测定SOD活性,观察pH对酶的影响,确定其最适pH。
酶液分别在pH 3、pH 4、pH 5、pH 6、pH 7、pH 8、pH 9、pH 10、pH 11的柠檬酸–磷酸二氢钾–巴比妥缓冲液[
2.2.4.3. 酶的时间稳定性
将酶液分别放置在室温、自然光照下和室温、避光条件下保存,每天定时在25℃,pH 8.2的Tris-HCl缓冲体系测其活力,每项测定至少重复3次,观察其时间稳定性。
图1显示,邻苯三酚反应初始中间产物吸收值随时间的增加而增大,但吸收峰一直在320 nm处,故测定邻苯三酚自氧化速率时波长应选择为320 nm。
从图2看出,邻苯三酚自氧化速率随着反应体系终浓度的增加而变大,终浓度 < 0.2 mmol/L时,其自氧化速率与时间呈线性关系(= 0.9979、= 0.9974、= 0.9950);终浓度 > 0.2 mmol/L时,其自氧化速率与时间的线性相关程度降低,随时间的延长逐渐趋于抛物线(R2 ≤ 0.9937),且终浓度越大这种变化趋势越明显。因此,用邻苯三酚自氧化法测定SOD活性时终浓度应不超过0.2 mmol/L。
图1. 邻苯三酚自氧化中间产物的波长扫描
图2. 在不同终浓度下邻苯三酚自氧化速率
温度对钝顶节旋藻SOD的影响呈钟罩形曲线(图3A)。0℃时,SOD活性维持较高水平;<25℃时,SOD活性随温度的升高而增加;>25℃时,随温度的升高SOD活性减小;25℃时SOD活性达到最高,为162 U/mL。低于25℃时SOD活性的变化比高于25℃时SOD活性变化较为缓慢,说明较高温度对SOD影响比较明显。
图3B和图3C呈半梯形图,在0~35℃(40℃)范围内,SOD的活性较稳定;>35℃(或40℃)时SOD活性开始几乎呈线性下降,65℃(或70℃)时SOD活性丧失;其中,保温60 min与20 min相比,SOD活性开始下降点和活性消失点均低5℃。表明,酶在高温水浴里保温的时间越长,SOD稳定性越差。
pH对钝顶节旋藻SOD的影响曲线也呈钟罩形(图4A)。由图可知,SOD的活性在Ph 8.2时达到最大值,缓冲溶液的pH值在8.2以下时酶的活性随着pH的增大而升高,大于8.2时随着pH的增大而降低,确定此酶的最适pH为8.2。
图4B显示,pH 6~10之间SOD活性基本稳定,pH < 6时,随着缓冲溶液的pH增大SOD活性逐渐增加,pH > 10时酶活力呈线形下降,pH 13时SOD活性完全丧失。
图3. 温度对SOD活性的影响(A)及其热稳定性(B、C)曲线B:保温20 min;C:保温60 min
图4. pH对SOD活性的影响(A)及其pH稳定性(B)曲线
图5显示,钝顶节旋藻SOD活性的时间稳定性曲线是半梯形图,粗酶液在室温、自然光照下放置2 d后SOD活性呈线性下降,第6 d时SOD活性只剩20%,7 d时其活性完全丧失;而室温、避光保存时,SOD活性4 d后才开始下降,第9 d时SOD基本无活性。
SOD活性的测定是建立在邻苯三酚自氧化的基础上,对SOD粗酶液性质的测定结果显示其最适温度为25℃、最适pH为8.2,因而测定邻苯三酚自氧化速率条件选择了25℃和pH 8.2,这与多数文献[3,4,6,7]报道的一致。但波长扫描结果显示,邻苯三酚的最大吸收波长为320 nm,这与刘华等[
图5. SOD活性的时间稳定性
测定波长325 nm要低,可能和实验环境不同或与仪器的差异有关。
本文对鄂尔多斯高原碱湖钝顶节旋藻SOD的最适温度和pH值的测定与夏文超[
夏文超等在测定乍得湖钝顶螺旋藻纯酶液的温度稳定性提出,酶活性在不同温度下保温10 min时,55℃以下活性基本稳定,温度升高至60℃时酶活力开始下降。本文研究结果显示,将粗酶液在55℃保温20 min和60 min时SOD活性仅剩57%和20%。分析结果不同的原因:一是SOD活性除了与保温温度有关以外还与保温时间的长短有关,在较高温度下保温的时间越长其活性消失的会越快;其次乍得湖钝顶螺旋藻原产地属于亚热带,其耐热性要比鄂尔多斯高原碱湖钝顶节旋藻强;还可能与所用SOD样品有关,提纯的酶液含杂质少,热稳定性比粗酶液强。
测定pH对SOD活性影响时(图4A),在pH 6.8时,测出的SOD的活性几乎为0,而从SOD的pH稳定性曲线(图4B)可看出,pH在6~7时SOD活性较高,由此推测,pH 6.8的偏酸环境下SOD仍具有活性,只是邻苯三酚的自氧化受到影响,导致测定结果为0。这也与文献[
鄂尔多斯高原碱湖钝顶螺旋藻是纯天然耐低温、广温型藻种[
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