目的:探讨miRNA-200c和E-cadherin在三阴性乳腺癌(TNBC)中的表达及临床意义。方法:用荧光定量PCR检测60例TNBC组织及50例正常乳腺组织中miRNA-200c和E-cadherin的表达,分析其表达与TNBC临床病理特征的关系。结果:miRNA-200c和E-cadherin在TNBC组织中的表达水低于正常乳腺组织(P < 0.05),其表达与TNBC的临床分期、组织学分级及淋巴结转移相关(P < 0.05)。miRNA-200c和E-cadherin在TNBC中的表达呈正相关(P < 0.05)。结论:miRNA-200c和E-cadherin可能参与TNBC的进展及转移过程,可能成为新的肿瘤标志物。 Objective: To investigate the expression and clinical significance of miRNA-200c and E-cadherin in triple negative breast cancer (TNBC). Methods: The expression of miRNA-200c and E-cadherinin in 60 TNBC tissues and 50 normal tissues was detected by fluorescent quantitation PCR, and the cor-relation between its expression and clinicopathological features of TNBC was analyzed. Results: The expression level of miRNA-200and E-cadherinin in TNBC tissue was significantly lower than that in normal breast tissue (P < 0.05), and its expression was correlated with lymph node metastasis, tu-mor stage, histological grade in TNBC tissue (P < 0.05). There was a positive correlation between miRNA-200c and E-cadherin expression in TNBC (P < 0.05). Conclusions: miRNA-200c and E-cadherin may be involved in the development and metastasis of TNBC, and may become new tu-mor markers.
目的:探讨miRNA-200c和E-cadherin在三阴性乳腺癌(TNBC)中的表达及临床意义。方法:用荧光定量PCR检测60例TNBC组织及50例正常乳腺组织中miRNA-200c和E-cadherin的表达,分析其表达与TNBC临床病理特征的关系。结果:miRNA-200c和E-cadherin在TNBC组织中的表达水低于正常乳腺组织(P < 0.05),其表达与TNBC的临床分期、组织学分级及淋巴结转移相关(P < 0.05)。miRNA-200c和E-cadherin在TNBC中的表达呈正相关(P < 0.05)。结论:miRNA-200c和E-cadherin可能参与TNBC的进展及转移过程,可能成为新的肿瘤标志物。
三阴性乳腺癌,荧光定量PCR,临床病理学,转移
Pai Peng, Kai Zheng, Menghe Chen, Chaohua Hu, Yuntao Han*
Department of General Surgery, Xiaogan Hospital Affiliated to Wuhan University of Science and Technology, Xiaogan Hubei
Received: Dec. 17th, 2022; accepted: Jan. 9th, 2023; published: Jan. 19th, 2023
Objective: To investigate the expression and clinical significance of miRNA-200c and E-cadherin in triple negative breast cancer (TNBC). Methods: The expression of miRNA-200c and E-cadherinin in 60 TNBC tissues and 50 normal tissues was detected by fluorescent quantitation PCR, and the correlation between its expression and clinicopathological features of TNBC was analyzed. Results: The expression level of miRNA-200and E-cadherinin in TNBC tissue was significantly lower than that in normal breast tissue (P < 0.05), and its expression was correlated with lymph node metastasis, tumor stage, histological grade in TNBC tissue (P < 0.05). There was a positive correlation between miRNA-200c and E-cadherin expression in TNBC (P < 0.05). Conclusions: miRNA-200c and E-cadherin may be involved in the development and metastasis of TNBC, and may become new tumor markers.
Keywords:TNBC, Fluorescent Quantitation PCR, Clinicopathology, Metastasis
Copyright © 2023 by author(s) and Hans Publishers Inc.
This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0).
http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
三阴性乳腺癌是指雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体-2的表达均为阴性的乳腺癌,约占所有乳腺癌病理类型的15%~20% [
miRNA是一类机体内源性表达的、长度在18~25个核苷酸的非编码小分子RNA,具有时空特异性,并参与基因转录后水平的调控,它通过与靶mRNA的3’非翻译区(3’UTR)不完全或完全互补配对,而引起靶mRNA的翻译抑制或降解 [
本项目用Realtime PCR检测miRNA-200c和E-cadherin在三阴性乳腺癌及其配对的癌旁正常组织中的差异表达,探索其表达与三阴性乳腺癌临床病理参数的相关性,用Spearman秩相关检测两者表达相关性,明确其在三阴性乳腺癌的发生、进展中的作用,为肿瘤的研究及治疗开辟新途径。
选取2018年1月~2019年1月在武汉科技大学附属孝感医院进行手术并病理检查证实为TNBC的60例患者的组织及完整病例资料,同时选取60例切除肿瘤标本周围正常乳腺组织(距肿瘤边缘 ≥ 5 cm)作为对照组,所有的组织切下来后放入−80℃的冰箱保存,用于提取总的RNA。所有患者均为女性,年龄23~70岁,中位年龄50.4岁;患者术前均未进行新辅助化疗;所有患者免疫组织化学检测ER、PR及HER-2为阴性;对免疫组织化学检测HER-2为阳性(++)的患者同时进行FISH检测,排除HER-2阳性患者。临床分期:I期28例,II期23例,III期9例;组织学分级:I级28例,II级20例,III级12例;腋窝淋巴结转移患者21例,无淋巴结转移39例;Ki-67高表达46例,低表达14例。本研究通过医院医学伦理委员会批准,患者签署知情同意书。
取100 mg组织放入液氮预冷的研钵中,将组织块迅速研磨成粉末,加入1 ml Trizol在1.5 ml离心管中充分匀浆,室温静置5 min;加入0.2 ml氯仿,振荡、静置、离心、取上清,再加入加入乙醇,萃取RNA,再用260 nm波长分光测定RNA浓度。
实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)试剂购 自上海捷瑞生物工程有限公司,Prime Script反转录试剂盒、TRIzol试剂为日本TaKaRa公司产品,ABI7500 PCR仪为美国ABI公司产品,DNA Marker购自上海捷瑞生物工程有限公司,引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成,SYBR Green I染料、RG-BOX紫外凝胶成像系统为美国Gene公司产品,ND-2000微量核酸定量仪购自美国Thermo Fisher公司;
取总RNA 2 μl,用反转录试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit试剂盒)和随机引物合成cDNA。反转录反应体系:5 × Prime Script缓冲液4 μl,Prime Script反转录酶I 1 μl,反转录Primer Mix 1 μl,RNA 2 μl,随机6核苷酸引物1 μl, RNase Free dH2O补至20 μl;反转录反应条件:37℃ 15 min,85℃ 5 s,4℃保持。将反转录得到的cDNA −20℃保存备用。
采用实时荧光定量PCR法(ABI 7500 PCR系统)检测miR-200c、E-cadherin mRNA表达水平,反应条件为95℃ 30 s,95℃ 5 s、60℃ 34 s共40循环。引物序列:miR-200c,F为5'-CCATGTGCTGGTGTGTGAA-3',R为5'-TGTGTTTTAGTTCAATGATGATCCA-3';内参β-actin,F:5'-GTGACGTTGACATCCGTAAAGACC-3';R:5'-GCTAGGAGCCAGGCAGTAATCT-3';E-cadherin,F:5'-AAGTGCTGCAGCCAAAGACAGA-3';R:5'-AGGTAGACCCACCTCAATCATCCTC-3',内参β-actin,F:5'-GTGACGTTGACATCCGTAAAGACC-3';R:5'-GCTAGGAGCCAGGCAGTAATCT-3';扩增完成后按仪器默认条件进行溶解曲线分析,为确定反应一致性,每次PCR重复3次。数据用RQ = 2−ΔΔCt表示相对定量结果,以U6作为内参,每个组织,样本独立实验三次。ΔCt = [Ct(miRNA) − Ct(U6)]或者[Ct(E-cadherin) − Ct(β-actin)],ΔΔCt = [ΔCt(癌) − ΔCt(正常)],2−ΔΔCt表示癌组织中的miRNA相对于正常组织的倍数差异,即miRNA在两组表达的相对差异。
所有数据使用SPSS23.0软件进行。独立样本t检验分析TNBC及癌旁正常组织中miRNA-200c和E-cadherinmRNA的表达差异。以平均表达值作为截点将三阴性乳腺癌组织中miRNA-200c和E-cadherinmRNA的表达分为低表达组和高表达组,用卡方检验分别分析miRNA-200c和E-cadherin mRNA表达与临床病理指标的关系。Pearson相关系数检测结肠癌组织中miRNA-200c和E-cadherin mRNA表达的相关性,所有统计以P < 0.05有统计学意义。
miRNA-200c、E-cadherin以及内参β-actin的扩增效率各自生成,三基因扩增效率均为R2 > 0.995。三个基因扩增产物的溶解曲线均都只有一个峰,有很好的特异性,PCR产物均在高于84℃以上获得单一溶解峰,确定为目的产物。
60例TNBC及癌旁正常组织中miRNA-200c、E-cadherin表达分别进行检测,结果表明与正常组织相比,miRNA-200c、E-cadherin在中表达TNBC明显降低,且差异具有统计学意义(P < 0.05,见图1)。
图1. miRNA-200c和E-cadherin在TNBC和癌旁正常组织中的表达
分别以miRNA-200c和E-cadherin的平均表达值作为截断值,将表达值分为高表达组和低表达组得到计量资料。miRNA-200c和E-cadherin在TNBC中呈低表达,其表达值显著低于癌旁正常组织(P < 0.05,见表1);另外,miRNA-200c和E-cadherin的表达与肿瘤的组织学分级、淋巴结转移、分期显著相关(P < 0.05,见表2),而与患者的年龄、肿瘤大小、KI-67无显著相关性(P > 0.05,见表2)。
组织类型 | 例数 | miRNA-200c | c2 | P值 | E-cadherin | c2 | P值 | ||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
高表达 | 低表达 | 高表达 | 低表达 | ||||||
癌组织 | 60 | 42 | 18 | 4.582 | 0.032 | 40 | 20 | 7.822 | 0.005 |
正常组织 | 50 | 25 | 25 | 20 | 30 | ||||
表1. miRNA-200c和E-cadherin在TNBC和癌旁正常组织中的表达
影响因素 | 例数 | miRNA-200c | c2 | P值 | E-cadherin | c2 | P值 | |||||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
高表达 | 低表达 | 高表达 | 低表达 | |||||||||||||||
年龄 | ||||||||||||||||||
≤45岁 | 28 | 16 | 12 | 0.097 | 0.755 | 15 | 13 | 0.076 | 0.782 | |||||||||
>45岁 | 32 | 17 | 15 | 16 | 16 | |||||||||||||
KI-67表达 | ||||||||||||||||||
≥20% | 40 | 20 | 20 | 0.133 | 0.715 | 18 | 22 | 0.134 | 0.714 | |||||||||
<20% | 20 | 11 | 9 | 10 | 10 | |||||||||||||
肿瘤大小 | ||||||||||||||||||
≥2 cm | 16 | 8 | 8 | 0.024 | 0.876 | 9 | 7 | 0.548 | 0.459 | |||||||||
<2 cm | 44 | 21 | 23 | 20 | 24 | |||||||||||||
肿瘤TNM分期 | ||||||||||||||||||
I | 28 | 21 | 7 | 20 | 8 | |||||||||||||
II | 23 | 11 | 12 | 6.559 | 0.038 | 13 | 10 | 6.835 | 0.033 | |||||||||
III | 9 | 3 | 6 | 2 | 7 | |||||||||||||
淋巴结转移 | ||||||||||||||||||
无 | 39 | 24 | 15 | 4.348 | 0.037 | 26 | 13 | 4.538 | 0.033 | |||||||||
有 | 21 | 7 | 14 | 8 | 13 | |||||||||||||
组织学分级 | ||||||||||||||||||
I | 28 | 19 | 9 | 20 | 8 | |||||||||||||
II | 20 | 7 | 13 | 6.705 | 0.035 | 6 | 14 | 8.619 | 0.013 | |||||||||
III | 12 | 4 | 8 | 5 | 7 | |||||||||||||
表2. miRNA-200c和E-cadherin的表达与临床病理学之间的关系
应用Pearson相关系数对TNBC中miRNA-200c和E-cadherin表达水平进行相关性分析,结果显示两者呈显著正相关(r = 0.521, P < 0.05)。
肿瘤的发生及进展是多基因、多阶段的病理过程,转移是肿瘤的最恶性特征体现,也是肿瘤患者最主要死亡原因 [
目前,研究表明miRNA在细胞增殖及侵袭、B细胞存活、胰腺分泌胰岛素、肿瘤发生及进展、转移方面研究是目前的热点。在乳腺癌中,miRNA在乳腺癌的发生、增殖、侵袭、转移中起着重要的作用 [
E-cadherin是由cdh1基因转录成的依赖Ca2+的跨膜糖蛋白,其主要在上皮细胞表达,是上皮细胞间彼此连接的重要蛋白 [
另外,miRNA-200c和E-cadherin两者表达在TNBC中呈正相关,表明两者表达具有一致性,两者的表达均与肿瘤的分期、淋巴结转移、组织学相关,肿瘤的分期越高、淋巴结转移越多及组织学分级越高,两者蛋白表达强度越低,表明两者在肿瘤的转移中起重要的负调节作用,可能的机制是miRNA-200c通过调控E-cadherin的表达,引起肿瘤组织中钙粘蛋白表达降低,肿瘤紧密连接减少,肿瘤可以迅速向外转移;另外,肿瘤分化越低,肿瘤的侵袭性及越强,与周围组织连接越少,越容易向外浸润转移。
总之,miRNA-200c和E-cadherin可能均参与肿瘤进展,两者的表达与肿瘤的分期、淋巴结转移、组织学相关,属于肿瘤负调节分子,miRNA-200c可能通过调节E-cadherin的表达发挥作用,有待进一步实验研究。
孝感市自然科学基金(XGKJ2019010014)。
彭 湃,郑 凯,陈梦荷,胡超华,韩运涛. miRNA-200c和E-Cadherin在三阴性乳腺癌中的表达及意义Expression and Clinical Significance of miRNA-200 and E-Cadherin in Triple Negative Breast Carcinoma[J]. 临床医学进展, 2023, 13(01): 467-473. https://doi.org/10.12677/ACM.2023.131069