本文以褐黄孢链霉菌 HBJ591 为基础,研究了补糖工艺对纳他霉素发酵的影响,结合发酵培养基的优化,实现了纳他霉素的高产发酵。结果表明,维持发酵罐中还原糖浓度为 2.5% ,能有效延长纳他霉素的合成时间。通过响应曲面法对褐黄孢链霉菌 HBJ591 菌株的发酵培养基进行优化后,结合补糖工艺,在 16 L 发酵罐中进行补料分批发酵,纳他霉素的发酵水平达到 15.7 g/L ,比原始发酵工艺的效价提高 4.8 倍。 Based on the study of sugar supplement process, high efficient fermentation with Streptomyces gilvosporeus HBJ591 was carried out via the optimization of the fermentation medium. When the reducing sugar concentration in the fermenter was 2.5%, the synthetic course of natamycin was extended effectively. Response surface method was used to optimize the fermention medium of HBJ591, then fed-batch fermentation was carried out in 16 L fermenter, the natamycin fermentation level reached 15.7 g/L, and the highest yield was 4.8 times higher than the original process.
纳他霉素(Natamycin)是一种高效、广谱的抗真菌剂,能有效抑制或杀死霉菌、酵母菌、丝状真菌,降低致病性真菌毒素产生,自1955年由Struyk等人发现以来,因其无毒,且不致突变、不致癌、不致敏、不致畸,难溶于水和油脂,口服毒性小,并且对产品口感特性无任何影响等优点,已在乳制品、肉类、水果、饮料等食品工业中得到广泛的应用[
纳他霉素(Natamycin)主要由褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)[
本文在前期研究得到高产专利菌株(褐黄孢链霉菌HBJ591)的基础上,采用补糖工艺和响应曲面法培养基优化对纳他霉素发酵工艺进行研究,较系统的研究了影响HBJ591发酵纳他霉素的因素,有效提高纳他霉素发酵的效价。
褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus) HBJ591,本实验室专利菌株。
斜面种子培养基:葡萄糖10 g/L、大豆蛋白胨5 g/L、酵母粉3 g/L、麦芽浸出粉3 g/L、脱脂粉15 g/L pH 7.0。
种子培养基:豆饼粉1%、酵母粉0.3%、葡萄糖1.8% pH 7.2。
发酵基础培养基:豆饼粉2.8%、酵母粉0.85%、葡萄糖4.0% pH 7.2。
纳他霉素含量的测定:HPLC高效液相色谱法[
还原糖的测定:DNS法[
氨基氮的测定:甲醛法[
可溶性磷的测定:磷钼蓝–氯化亚锡比色法[
生物量的测定:定量称取5克发酵液,离心洗涤2次,将菌丝体于105℃烘干致恒重,生物量 = 干菌丝体量/发酵液量 × 100%[
HQL150B恒温冷冻摇床(中国科学院武汉科学仪器厂),Agilent 1100高效液相色谱仪,SP-752型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司),16 L全自动发酵罐(美国NBS公司)。
种子用二级培养,一级种为250 ml三角瓶摇瓶种子,每个三角瓶装培养基30 ml;二级种为500 ml三角瓶摇瓶种子,每个三角瓶装种子培养基50 ml,接种量10%。发酵温度:28℃~29℃;摇瓶装量:500 ml三角瓶装50 ml;摇床转速:220 r/min;摇瓶发酵周期:7天。
16 L发酵罐:发酵温度28℃~29℃,转速500 r/min,通风量1:1.6。
摇瓶补糖方法:从48小时开始每12小时向每个摇瓶补加1.5 ml 50%浓度的无菌葡萄糖。
16 L发酵罐的补糖方法:用50%浓度的无菌葡萄糖,通过蠕动泵用电子天平计量补入,维持还原糖浓度在2.5%左右。
通过检测不补糖条件下褐黄孢链霉菌HBJ591发酵过程中不同时间发酵液菌体生物量、纳他霉素效价、pH、还原糖、可溶磷及氨态氮等代谢参数,绘制代谢变化曲线如图1。
从图中可以看出,发酵24 h时褐黄孢链霉菌生物量达最大值,此时pH下降到5.0左右,氨基氮和可溶性磷下降;在发酵8小时开始检测到纳他霉素产生,还原糖约为2.0%~3.5%,期间纳他霉素大量合成,在还原糖低于2.0%后,纳他霉素合成减缓,64 h达高峰,纳他霉素产量为2.7 g/L发酵液,说明葡萄糖浓度2.0%可能是发酵关键点。
根据上述试验结果,设计在还原糖降到2.0%时开始补加葡萄糖,长时间维持发酵液中还原糖的浓度在2.0%~3.0%,监测纳他霉素的产量,见图2。从图2中可以看出,纳他霉素的合成时间可延长至120小时,
图1. 不补糖条件下纳他霉素发酵参数变化曲线
图2. 维持还原糖浓度为2.0%~3.0%时残糖和效价变化曲线
此时纳他霉素效价最高,可达到6.1 g/L发酵液,比不补加葡萄糖提高了1.3倍。
试验设3个葡萄糖浓度处理,分别维持发酵液中还原糖浓度为2.0%(A)、2.5%(B)、3.0%(C)以上,监测发酵过程中纳他霉素的产量变化。结果显示,维持发酵液中还原糖浓度2.5%以上,褐黄孢链霉菌HBJ591发酵产生纳他霉素效价最高,效价达到9.4 g/L,葡萄糖转化率为5.42%。表1显示维持发酵液中2.5%还原糖浓度处理与其他两个处理有极显著差异,能明显促进纳他霉素的产生,推测较低或过高还原糖浓度均会影响褐黄孢链霉菌HBJ591纳他霉素的合成速度。
维持发酵液中还原糖浓度2.5%以上,对褐黄孢链霉菌HBJ591发酵生产纳他霉素最有利,监测该发酵条件下菌体生物量、纳他霉素效价、pH、还原糖、可溶磷及氨态氮等参数,绘制代谢变化曲线如图3。结果显示:维持2.5%还原糖浓度能使氨基氮和可溶性磷在纳他霉素快速合成时维持相对低水平,pH缓慢下降,同时生物量缓慢增加,纳他霉素的合成在60~80小时期间相对减缓,稍后又恢复快速合成,到120小时纳他霉素产量达到最高值10.1 g/L,葡萄糖转化率为
表1. 维持发酵液中不同糖浓度下的纳他霉素效价方差分析
图3. 最佳还原糖浓度的纳他霉素代谢参数曲线
6.09%。比不补糖条件下纳他霉素发酵最高效价提高了2.7倍,120小时后,由于菌丝衰老,纳他霉素合成速率减缓,发酵液中纳他霉素浓度不再增加。
利用响应曲面法对发酵培养基优化,并在16 L发酵罐中进行了放大试验,按照上述方案在发酵进行的48小时的时候进行补糖,其最高效价在120小时,效价为15.7 g/L,与条件优化前比较,纳他霉素发酵效价提高了4.8倍[11-14]。
维持2.5%以上的还原糖浓度条件下,纳他霉素大量合成时,发酵液中的可溶性磷在5~10 ug/ml,但是在56~80小时纳他霉素合成速率减缓,此时可溶性磷大于10 ug/ml,结合生物量的生长趋势,表明限制可溶性磷的浓度并且保持菌体适当的生长速率有利于纳他霉素的合成[
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