大量流行病学研究表明,大豆异黄酮具有明显的抗癌、抗氧化、抗炎、防护心脑血管以及预防骨质疏松等多种生理功能。被人和其他哺乳动物摄入体内的大豆异黄酮在胃肠道菌群作用下可被降解为二氢黄豆苷原、二氢染料木素、去氧甲基安哥拉紫檀素、雌马酚等不同代谢产物。体内及体外研究结果均表明,大豆异黄酮代谢产物具有比大豆异黄酮更高、更广的生物学活性。迄今,已有大量大豆异黄酮代谢产物产生菌从不同动物胃肠道微生物菌群中被分离出来。目前,人们正专注于从已分离的大豆异黄酮转化菌株中克隆相关转化酶基因。本文将对大豆异黄酮转化菌株分离及相关转化酶基因克隆现状作一综述。 Epidemiological studies have shown that soy isoflavones have many important physiological activities, such as anticarcinogenic, antioxidant, antiinflammation, protection of cardiovascular diseases, prevention of osteoporosis etc. Isoflavones can be converted to different metabolites, including dihydrodaidzein (DHD), dihydrogenistein (DHG), O-desmethylangolensin (O-Dma), equol etc., by gastrointestinal microflora of humans and other mammals. Both in vitro and in vivo studies have indicated that isoflavone metabolites are of stronger and wider bioactivity than that of isoflavones themselves. To date, many specific bacterial strains capable of biotransforming isoflavones have been isolated from the microflora living in gastrointestinal tract of different animals. At present, researchers are focusing on cloning of genes encoding different biotransforming enzymes from isolated bacterial strains responsible for biotransforming isoflavones. This paper will review the isolated bacterial strains for biotransforming isoflavones and cloning of genes encoding for relative biotransforming enzymes.
异黄酮(Isoflavones)虽是黄酮化合物中的一类,但分布范围较窄,常见的食用植物中仅大豆、葛根、苜蓿和三叶草中含有异黄酮,人体摄入的异黄酮几乎全部来自大豆[1,2]。迄今,从大豆中分离的异黄酮有12种,分为游离型苷元(Aglycone)和结合型糖苷(Glucoside)两大类。天然大豆中的异黄酮绝大部分以葡萄糖苷、乙酰基葡萄糖苷和丙二酰基葡萄糖苷等结合型糖苷存在,以游离型苷元存在的大豆异黄酮共有3种,即黄豆苷原(Daidzein)、染料木素(Genistein)和6-甲氧黄豆苷原(Glycitein),其中黄豆苷原和染料木素占大豆异黄酮总苷元的95%~97%,为大豆异黄酮苷元的主要成分。流行病学和实验室研究结果均表明,大豆异黄酮具有明显的抗氧化[
被摄入机体的结合型大豆异黄酮糖苷在肠道和肝组织中的β-葡萄糖苷酶作用下首先被水解为游离型苷元,进而被胃肠道内的微生物菌群降解为各种不同代谢产物。大豆异黄酮的不同代谢产物具有不同的生理活性,这主要取决于代谢产物的化学结构。在目前已知的大豆异黄酮的所有代谢产物中,雌马酚被认为是活性最高的成分,其抗氧化活性比亲本化合物黄豆苷原高出100多倍[
由于受饮食、胃肠疾病以及长期心理压力等众多因素影响,不同动物种类以及同种动物的不同类群或个体的肠道微生物菌群在代谢大豆异黄酮上存在较大差异,如人群中只有30%~50%的个体能将摄入体内的黄豆苷原转化为雌马酚。从上世纪90年代末,国内外学者开始从不同动物胃肠道微生物菌群中分离对大豆异黄酮具有转化作用的单一微生物菌株,目前已有大量大豆异黄酮转化菌株被分离和鉴定。从已报道的大豆异黄酮转化菌株的耐氧性来看,除两株细菌菌株被提及能在有空气氧条件下生长外,其他大豆异黄酮转化菌株则全部为严格厌氧细菌菌株。日本学者Uchiyama等[
从大豆异黄酮转化菌株中克隆相关转化酶基因并在大肠杆菌中进行表达,可以实现大豆异黄酮代谢产物在有氧条件下的高效合成。近些年,人们开始从大豆异黄酮转化菌株,尤其是具有较强抗癌活性的雌马酚产生菌中克隆相关转化酶合成基因。本文将对大豆异黄酮转化菌株分离及相关功能基因克隆现状作一综述。
自上世纪90年代末,国内外学者开始从不同动物胃肠道微生物菌群中分离能将大豆异黄酮进行转化的特定微生物菌株。Hur等[
经过十余年的努力,国内外学者已从不同动物胃肠道微生物菌群中分离了近20株大豆异黄酮转化菌株,这些转化菌株主要集中在红蝽菌科(Coriobacteriaceae)的真杆菌属(Eubacterium)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)和乳杆菌属(Lactobacillus)等几个属。此外,还有一些大豆异黄酮转化菌株被鉴定为新的分类单元,这些新分类单元被赋予了新的属名或种名,如Adlercreutzia equolifaciens[
早在20世纪60年代末和70年代初,人们就分别以反刍动物牛和羊为研究对象,对黄豆苷原和染料木素在动物体内的代谢进行了研究,检测到DHD、O-Dma、雌马酚和DHG等不同代谢产物。进入20世纪90年代,随着化学检测手段的不断提高,又从人及小鼠等的尿液和粪便中检测到THD、6’-羟基-雌马酚(6’-OH-Equol)、6’-羟基-去氧甲基安哥拉紫檀素(6’-OH-O-Dma)、2,3-不饱和-去氧甲基安哥拉紫檀素(2-Dehydro-O-Dma)、2-HPPA和4-乙基苯酚(4-Ethylphenol)等多种异黄酮代谢产物[32-34]。澳大利亚学者Joannou等[
表1. 已分离的具有不同转化功能的大豆异黄酮转化菌株
图1. 大豆异黄酮黄豆苷原(左)和染料木素(右)在人体内的代谢途径假说
图2. 大豆异黄酮染料木素在大鼠体内的代谢途径
为实现大豆异黄酮代谢产物的高效有氧生物合成,近几年人们开始对大豆异黄酮转化菌株中的转化酶基因进行克隆研究,目前已从不同雌马酚产生菌中分别克隆了黄豆苷原还原酶、DHD还原酶和THD还原酶等大豆异黄酮转化酶基因。从能查找的文献来看,大豆异黄酮转化酶基因克隆方法主要包括功能克隆法、反向PCR法、文库筛选法以及全基因组测序法,现将大豆异黄酮转化酶基因克隆方法以及克隆出的相关转化酶基因加以综述。
1) 功能克隆法
功能克隆法又称多肽氨基末端序列指导的PCR引物合成法,即对目的蛋白进行高度纯化后对其N-端氨基酸序列进行测定,根据氨基酸序列反推出相应的基因序列,进而设计引物进行功能基因克隆。该基因克隆方法是借助于基因表达的产物即蛋白质将该功能基因克隆出来,成败的关键在于能否得到纯度极高的目的蛋白。日本学者Shimada等[
2) 反向PCR法
当大豆异黄酮代谢途径中的某个关键酶基因已知时,可运用反向PCR法直接扩增该基因上游和下游的部分基因,这是功能基因克隆中最为简便和直接的方法。当Shimada等从乳酸球菌20-92中成功克隆了黄豆苷原还原酶基因L-DZNR后,他们继续对黄豆苷原还原酶L-DZNR上下游基因序列进行了克隆分析,结果又发现了6个新基因,即orf-US4,orf-US3,orf-US2,orf-US1,orf-DS1和orf-DS2。通过构建重组体,并对重组蛋白进行活性分析发现,两个上游基因orf-US2和orf-US3与雌马酚生物合成相关。基因orf-US2编码的蛋白质在厌氧条件下能将底物DHD还原为cis/trans THD,编码该蛋白的基因被命名为DHD还原酶(L-DHDR);基因orf-US3编码的蛋白质在厌氧条件下则能将底物cis/trans THD还原为雌马酚,编码该蛋白的基因被命名为THD还原酶(L-THDR),而其余四个基因的功能目前尚不能确定[
3) 文库筛选法
通过构建基因组文库也可筛选到大豆异黄酮转化菌株的转化酶基因。Tsuji等[
4) 全基因组测序法
对菌体全基因组进行测序后,运用功能基因组学进行对比分析也是获得功能基因的重要手段。日本学者Yokoyama等于2012年采用全基因组鸟枪法分别对两个大豆异黄酮转化菌株的全基因组进行了测序,其中一个菌株为能在厌氧条件下将黄豆苷原转化为雌马酚的细菌菌株Eggerthella sp. YY7918(AB379693),其基因组全序列长度为3,123,671 bp,预测包括2680个蛋白质编码序列(CDS),该菌株的基因组全序列目前已存放在GenBank/DDBJ/EMBL基因数据库中(AP012211)[
大豆异黄酮代谢产物具有比大豆异黄酮更高、更广的生物学活性,然而,在大豆异黄酮代谢产物中,目前只有DHD和雌马酚可利用化学加氢法进行人工合成。大豆异黄酮转化菌株的成功分离虽为大豆异黄酮代谢产物的生物合成提供了可能,但长期维持严格厌氧环境成本极高。近年来人们开始对雌马酚产生菌的相关转化酶基因进行克隆,试图利用功能基因的异源表达来实现雌马酚的高效有氧合成。目前人们只是对雌马酚产生菌的转化酶基因进行了克隆。通过对比分析来自不同雌马酚产生菌的相同功能的基因序列,发现其基因序列存在较大差异,如从菌株Slackia sp. NATTS中克隆的黄豆苷原还原酶基因orf-3与从乳酸球菌20-92中克隆的黄豆苷原还原酶L-DZNR的基因序列相似性仅为42%[
本研究得到国家自然科学基金(No.31170058)和河北省百名优秀创新人才支持计划(CPRC027)资助,在此深表谢意。
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