采用HPLC法测定不同白芍药材中芍药苷含量,确定哪种白芍含芍药苷最高。方法:采用色谱柱:Hypersil C18柱(4.6 × 200 mm,5 μm);流动相:乙腈/0.05%磷酸水(14:86);检测:UV 230 nm;流速:1.0 ml/min;柱温:25℃。结果表明:2年生、10月份采收贮存期短的亳白芍芍药苷含量最高。该方法简便,准确可靠,重复性好。 To compare the quality on different Radix Paeoniae Alba using HPLC methods. Column: Hypersil C18 column (4.6 × 200 mm, 5 μm); mobile phase: acetonitrile-H2O (acidified to 0.05% with phosphoric acid) (14:86); UV test: 230 nm; flow-rate: 1.0 ml/min; column temperature: 25˚C. There was the highest content of paeoniflorin in Radix Paeoniae Alba of two-year-growing time, harvest time in October and short storage time from Bozhou. The assay methods are simple, rapid and with good reproducibility.
白芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根[
CAMAG点样器Linomat 5,CAMAG双槽展开箱,CAMAG薄层色谱摄像仪(REPROSTAR 3);超声波清洗器(上海超声波仪器厂)。高效液相色谱仪(四元泵、柱温箱、MVD检测器、Agilent1100色谱工作站)、电子分析天平AE240(十万分之一,瑞士,METTLER-TOLEDO Co.);硅胶G(60型)预制板10 × 20 cm(青岛海洋化工集团公司出品国家药典会监制),乙腈为色谱纯(Merk Co.),水为双蒸水,其它试剂均为分析纯,购自江西南昌市东方仪器试剂公司。水为双蒸水(自制)。
对照品与对照药材:芍药苷(Paeoniflorin,编号:0900-200102,含量测定用);芍药对照药材(编号:1243- 0301),均购于中国药品生物制品检定所,白芍药材经甘肃中医学院药用植物学科组鉴定符合2005年版《中国药典》白芍项下标准。
1) 对照品溶液的制备:称取芍药苷对照品适量,加乙醇制成每1 ml含1 mg的溶液,作为对照品溶液。
2) 供试品溶液的制备:取本品粉末0.5 g,加乙醇10 ml,超声提取15分钟,放冷,过滤,滤液蒸干,残渣加乙醇1 ml使溶解,作为供试品溶液。
3) 对照药材溶液制备:称取白芍对照药材0.5 g,同“供试品溶液的制备”方法制备,即得。
4) 展开剂:氯仿/乙酸乙酯/甲醇/甲酸(40:5:10: 0.2)。
5) 显色剂:5%香草醛硫酸溶液。
6) 薄层板:硅胶G板。
7) 方法:分别吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液10 μl,点样,展开,取出,晾干,喷5%香草醛硫酸溶液,加热板95℃加热5 min,日光下检视。
1) 对照品溶液制备:精密称取白芍对照品适量,加50%乙醇制成每1 ml含60 g的溶液,摇匀,即得。
2) 供试品溶液的制备:精密称取本品干燥的粉末0.5 g,置50 ml容量瓶中,精密加入50%乙醇35 ml,超声提取30分钟,冷却,加50%乙醇至刻度,摇匀,滤过,再过0.45 μm滤膜,取续滤液作为供试品溶液。
3) 色谱条件:色谱柱:Hypersil C18柱(4.6 × 200 mm,5 μm)(大连Elite公司);流动相:乙腈/0.05%磷酸水(14:86);检测:UV 230 nm;流速:1.0 ml/min;柱温:25℃。理论塔板数以芍药苷峰计算不得低于2000。在上述色谱条件下,取对照品溶液、供试品溶液各进样10 μl进行HPLC测定。由图中可见供试品中芍药苷与芍药苷对照品峰保留时间一致,并且与样品中其它组分达到了很好的分离。
4) 线性关系考察:精密称取芍药苷对照品0.02480 g,置50 ml容量瓶中,加稀乙醇稀释至刻度,即得到2.48 mg/ml的芍药苷对照品溶液,从中分别精密吸取0.25 ml、0.5 ml、2.5 ml、5.0 ml、10.0 ml、和15.0 ml的对照品溶液,分别置6个25 ml的容量瓶中,用稀乙醇稀释至刻度,摇匀,即得对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液各10 μl,绘制标准曲线,得回归方程y = 1809.3984x + 2.2135,r = 0.99999。
5) 提取方法的确定:本实验对提取溶剂、提取溶剂的浓度、提取时间、提取方法等进行综合考察,最后确定供试品溶液的制备方法为:用50%乙醇超声提取30分钟即可。
6) 精密度试验:精密吸取同一份供试品溶液10 μl,重复进样6次,测定芍药苷峰面积积分值,RSD为0.80%。
7) 重现性试验:按“供试品溶液的制备”方法,对同一批样品分别制备6份供试品溶液,各吸取10 μl进样测定,测得芍药苷含量RSD为0.72%。
8) 稳定性试验:取同一份供试品溶液在上述色。
9) 回收率试验:采用加样回收测定法。采用加样回收测定法。分别精密称取已知含量(芍药苷1.778%)的样品约0.25 g,共6份,分别加入一定量的对照品(浓度为0.88 mg/ml,精密加入5 ml),按“供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液,进行HPLC测定,测得芍药苷的平均回收率为99.92%,RSD为1.36%;结果见表1。结果表明,本法回收率高。
表1. 回收率试验结果
图1. 白芍TLC图:图注:1. 芍药苷标品;2. 杭白芍;3. 白芍原药材(樟树产);4. 甘肃白芍(甘肃兰州);5. 武汉白芍;6. 白芍对照药材;7. 亳州白芍5年生;8. 亳州白芍4年生;9. 白芍炮炙品(安徽产)
供试品色谱图与对照药材、对照品色谱图相同位置上显相同颜色的斑点,各供试品斑点分离清晰,层析效果好,可以达到鉴别的目的。TCL图谱见图1。
图2. 芍药苷对照品含量图
图3. 白芍样品中芍药苷含量图
精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μl进样测定,结果见表2。
本实验所采用的上述以芍药苷为对照品对白芍药材进行薄层色谱定性鉴别的方法简便、可靠、重现性好,对原药材具有较强的专属性鉴别作用。但在白芍中芍药苷含量测定中,采用HPLC法进行测定,在定量方面,HPLC法更优于薄层色谱定性鉴别的方法,HPLC法进行定量测定更准确,更可靠,更稳定。
表2. 16批样品的芍药苷含量测定结果(n = 2)
从芍药苷含量测定结果看,不同产地的白芍芍药苷含量各不相同。其主要成分芍药苷含量以亳州产白芍最高;本实验所用亳州白芍为带皮的根,与文献[
从芍药苷含量测定结果看,以四川白芍为例,采收期8月份、9月份、10月份芍药苷含量不同,采收期在10月份芍药苷含量最高,与文献[
从白芍饮片1(贮存1年)、白芍饮片3(贮存2年)、白芍饮片4(贮存3年)芍药苷含量测定结果看,随贮存期的延长,白芍中芍药苷的含量呈下降趋势,所以白芍的贮存期不宜太长。
不同生长期毫白芍中芍药苷的含量不同,以2年生者含量最高,随着生长期的延长,芍药苷的含量呈下降趋势。据有关文献报道可能因为生长期长,淀粉含量增加,芍药苷在体内转化分解。这提示合理利用毫白芍资源,可缩短生长期,增加芍药苷含量,即经济又有效。
总之,根据上述测定结果,可见本法操作简单,重现性好,可作为白芍质量控制的有效方法。
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