DR1372基因是在耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans, DR)基因组中克隆得到的一个基因,其蛋白序列存在一个WHy功能域,此功能域可能参与油菜的抗旱过程。本研究首先构建植物DR1372- pBI121表达载体,然后利用农杆菌介导法将目的基因DR1372成功转入甘蓝型油菜中,并对影响油菜再生频率以及遗传转化效率的几个因素进行了探讨,初步建立了油菜转DR1372基因遗传转化体系,为DR1372基因的功能研究奠定了基础。<br/>The DR1372 containing a special domain called WHy was cloned from Deinococcus radiodurans. This WHy domain may be involved in the mechanism of drought resistance. In this study, the plant expression vector DR1372-pBI121 was constructed and introduced into Brassica napus L. mediated by Agrobacteria. Several factors affecting genetic transformation efficiency were explored and the Agrobacterium-mediated genetic transformation system was set up in Brassica napus. This study provides essential materials for later research on DR1372 gene.
耐辐射奇球菌因其对电离辐射、干燥、紫外线及一些DNA损伤试剂显示超强的抗性,一直倍受生物医学界的关注[
本实验室把DR1372基因转入大肠杆菌后,经初步定性分析发现,在大肠杆菌中有稳定细胞膜,调节细胞内外渗透压的作用,初步推测为与调节水分胁迫应答有关的基因。本研究首先构建植物DR1372- pBI121表达载体,利用农杆菌介导法将DR1372基因转入油菜中,并对影响油菜再生频率以及遗传转化效率的几个因素进行了探讨,初步建立了转DR1372基因油菜遗传转化体系,为该基因耐盐抗旱研究提供了植物材料,也为DR1372包括WHy功能域的功能研究奠定了基础。
含有携带基因DR1372的穿梭质粒(DR1372 + Z3)的大肠杆菌DH5α由中国农业科学院生物技术研究所提供。
根癌农杆菌EHA105以及大肠杆菌JM109由本实验室保存。
供试的甘蓝型油菜84100-18(玻里马细胞质雄性不育恢复系),由四川大学遗传学实验室提供。
LB液体培养基:用胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g,溶于ddH2O中,定容至1 L,pH 7.0,高压灭菌;
农杆菌摇菌培养基:LB + Rif 40 mg/L + Str 20 mg/L + 卡那霉素50 mg/L;
预培养基:MS + 6-BA 2.0 mg/L + AgNO3 2.5 mg/L + 2,4-D 1.0 mg/L + AS 100 umol/L;
筛选培养基:MS + 6-BA 2.0 mg/L + 卡那霉素10 mg/L + AgNO3 2.5 mg/L + Cab 500 mg/L;
生根培养基:1/2 MS + Cef 250 mg/L + NAA 0.15 mg/L。
根据DR1372基因序列,利用生物软件Primer5设计出该基因的上、下游引物(分别命名为DR1372-F,DR1372-R);根据pBI121质粒图谱,分别引入XbaI,SacI限制性酶切位点,并设计引物如下(加粗标记示酶切位点):
DR1372-F: 5’---GCTCTAGA ATGAAGAAGAT GGCTTTTGCG----3’
DR1372-R: 5’--- CGAGCTC TCAAAACACCGA TAAAGGCGC----3’
用试剂盒(TIANGEN)提取DR1372 + Z3质粒,以此作为模板,在最优扩增体系下进行DR1372基因PCR扩增。电泳验证。
用试剂盒(TIANGEN)提取pBI121质粒。电泳验证。
PCR产物经电泳检测后,使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANGEN)回收扩增的目的片段DR1372和与质粒pBI121。电泳验证。
目的片段DR1372和pBI121质粒用XbaI,SacI(购自Takara公司)进行双酶切,37℃酶切过夜,回收目的片段。将胶回收的目的基因片段和pBI121质粒大骨架片段,16℃连接过夜,重组质粒转化JM109感受态细胞。然后进行菌落PCR初步鉴定,将PCR检测出的阳性单克隆摇菌后送华大基因公司测序。最后挑取测序成功的JM109单菌落,继代培养,保菌。将保存菌种摇菌提取质粒,得到DR1372-pBI121植物表达载体。最后,将DR1372-pBI121植物表达载体导入农杆菌EHA105浸染备用,具体参照余云舟等方法[
将甘蓝型油菜种子用无菌水清洗两次,浸泡10 min,用75%乙醇消毒2 min后,灭菌水清洗两遍,然后用浓度为0.1%的升汞溶液消毒15 min,最后用灭菌水洗5遍。把消毒的油菜种子均匀地摆放在无植物激素的MS固体培养基上。在25℃室温下进行光照培养,生长5~6 d。
用剪刀剪取油菜无菌苗紧邻生长点以下约0.5 cm长的下胚轴,置于预培养基上,光照预培养1~4 d。
在50 mL农杆菌摇菌培养基中加入0.5 ml载有DR1372~pBI121植物表达载体的EHA105菌液,在28℃下200 rpm振荡培养过夜至对数生长期,OD600约为1.0左右。取上述菌液于4℃下5000 rmp离心15 min后,弃上清,收集菌体,用MS液体培养基重悬,将OD600值为1.0的菌液稀释为OD600 = 0.1、0.3、0.4和0.5。用上述不同浓度的菌液侵染已知数量的预培养下胚轴,侵染时间分别为50 s、90 s、130 s、170 s。侵染期间使外植体充分与菌液接触,然后取出浸染后的外植体,在灭菌滤纸上吸干多余菌液,重新转入预培养基中暗培养2 d后观察培养情况。
把暗培养2 d后的下胚轴转入到卡那霉素筛选培养基上进行筛选培养,每两周继代,直至再生出幼芽。当幼芽长到1~2 cm高时,去掉愈伤组织,并将幼芽转移到生根培养基中。待其生长到5~6 cm高,根长5~6 cm以及根的数量为10条以上时,半敞开培养瓶盖子进行炼苗;待幼苗适应外界环境以后,移栽到室内灭菌的盆土中(腐殖土:蛭石 = 2:1),并用1/2 MS培养液浇灌,移栽出一周内给小苗外罩烧杯保湿,最终得到具有卡那霉素抗性的油菜。
取甘蓝型油菜(非转基因型)和转基因再生的卡那霉素抗性植株叶片,用CTAB法提植物总DNA,具体方法参照文献《植物基因工程原理与技术》[
提取DR1372 + Z3质粒,电泳结果如图1(A)所示,目标基因条带清晰,无弥散现象,可以用于PCR扩增。利用DR1372-F和DR1372-R引物对DR1372基因进行PCR扩增,其电泳结果如图1(B)。DR1372基因分子大小为495 bp,条带位置正确,并为单一条带。最后对PCR产物进行胶回收。
提取pBI121质粒后进行电泳,其电泳结果如图1(C)所示,所提取的目标基因条带清晰,无弥散现象,可以进行酶切。
对DR1372胶回收产物进双酶切,经电泳胶回收后如图1(D)所示。同时对pBI121质粒进行双酶切,其电泳图和胶回收情况见图1(E)和图1(F)。
DR1372-pBI121质粒转化到JM109后,经培养后挑取抗卡拉霉素单菌落直接进行PCR扩增,其扩增的部分结果如图1(I),结果表明:有多个菌落显示为阳性,阳性克隆送去测序,测序反馈结果经基因软件分析,目的序列与DR1372序列完全一致,说明DR1372外源基因成功导入到了大肠杆菌JM109中。
将测序正确的JM109单菌落扩大培养后提取质粒并转化EHA105感受态,得到的单菌落进行菌落PCR验证,结果如图2。由图2可知,可以选择1~2、4~6号保菌做浸染外植体用,阳性率为66.67%。
我们的实验结果表明,对不经过预培养或预培养1 d的外植体进行农杆菌浸染,下胚轴分化不明显,感染后出现较严重的褐化和死亡现象,出芽率较低。当预培养时间为2 d左右时,对外植体进行侵染,出芽率达到最高的7.86%,与Charest[
图1. JM109菌落PCR验证
图2. EHA105的菌落PCR验证
使农杆菌很难侵染,玻璃化率以及白化率急剧增高,从而使出芽率降低。结果表明,对下胚轴进行2 d的预培养可得到最高7.86%的出芽率(表1)。
适宜的农杆菌感染浓度和感染时间是遗传转化成功与否的重要因素[
转DR1372抗性植株获得的过程如图3所示,共获得卡那霉素抗性植株169株,对其进行PCR检测如图4所示,有123株显示出阳性,阳性率为72.8%。
表1. 预培养时间对抗性芽率的影响
表2. 农杆菌菌液浓度和侵染时间对抗性芽率的影响
图3. 油菜在卡拉酶素筛选培养基上再生的抗性苗
图4. 转DR1372基因油菜PCR检测
本研究首先构建DR1372-pBI121载体,载体上带有一个GUS基因,以及CaMV35S强启动子和NOS终止子。将植物表达载体DR1372-pBI121载体导入农杆菌EHA105中,利用农杆菌介导法转化油菜下胚轴,得到卡那霉素抗性植株169株。提取抗性植株基因组DNA,经PCR检测,有123株显示为阳性,造成假阳性的原因可能是卡那霉素的筛选压强度不足导致。
在油菜下胚轴浸染农杆菌以后,预培养时间的长短对细胞正常分化有很大影响。预培养时间过长,下胚轴切段形成松散型的愈伤组织,这类愈伤组织转到分化培养基上大多变褐死亡[
Francesca D.等人的研究表明,WHy结构域在植物中具有抗水分胁迫和高敏反应等干燥应答功能[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[